LncRNA NPSR1-AS1在胃癌中的表達及作用機制

謝文杰,張鶴騰,唐銀炳,陸佳偉,侯雯躋,周曉東,徐穎,張文波,于強,鄒晨

(江蘇大學附屬人民醫院a.普外科,b.中心實驗室,c.神經外科,江蘇鎮江 212002)

據文獻報道,在消化系統腫瘤中胃癌的發病率位居前列，是癌癥患者死亡的主要原因之一[1]。LncRNA是長度大于200個核苷酸，缺乏蛋白質編碼能力，與DNA、RNA和蛋白質相互作用，在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平上發揮關鍵的調控作用[2]。LncRNA NPSR1-AS1主要定位于7號染色體p14.3。Huang等[3]從The Cancer Genome Atlas(TCGA)數據庫中分析了149例肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者的LncRNA表達模式以及相關的臨床數據，其認為NPSR1-AS1與HCC的預后相關，并有望成為HCC治療的靶標。此外，He等[4]根據微陣列分析，認為NPSR1-AS1是一種缺氧反應性LncRNA；缺氧誘導的NPSR1-AS1可能通過調節MAPK/ERK途徑來促進HCC細胞的增殖和糖酵解，并有望用于HCC治療[4]。為研究NPSR1-AS1與胃癌的關系，本研究檢測了NPSR1-AS1在胃癌患者組織及血漿中的表達情況，結合患者的臨床病理資料，分析其與NPSR1-AS1表達量的關系，同時，還進行了細胞功能學試驗及實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測腫瘤相關基因的表達，并進一步研究其作用機制，以期為臨床診療提供實驗依據。

1 資料和方法

1.1研究對象 收集2015年4月至2019年7月于江蘇大學附屬人民醫院普外科接受手術治療的86例胃腺癌患者的癌組織及相應的癌旁組織(距腫瘤邊緣>5 cm)。女性24例，男性62例，年齡47～82歲，中位年齡68歲；腫瘤最大徑>5 cm者22例，≤5 cm者64例；淋巴結轉移陰性者(N0)38例，陽性者(N1-3)48例；胃癌TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期46例。納入標準：(1)經病理科2名副主任醫師聯合診斷為胃腺癌；(2)所有患者術前均未接受放療、化療及其他非手術的抑癌療法。排除標準：(1)合并其他腫瘤者；(2)有高血壓、糖尿病、心臟病、肺部疾病和免疫系統疾病者。隨機選取上述胃癌患者中的21例(男性14例，女性7例，年齡52～76歲)，檢測血漿中NPSR1-AS1的表達水平。另外，隨機收集在本院體檢中心體檢的21例(男性12例，女性9例，年齡27～46歲)體檢健康者的血漿標本作為對照組。本研究經江蘇大學附屬人民醫院倫理委員會的批準(批準文號：K20180016Y)。所有受試者及家屬均知情同意。

1.2細胞系、試劑和儀器 胃癌細胞系AGS(中國科學院上海細胞庫)。RNA提取試劑(Trizol，美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(美國Sigma公司)，轉染試劑Lipofectamine 2000(日本TaKaRa公司)，siRNA-NPSR1-AS1小干擾RNA、陰性對照小干擾 RNA(上海吉瑪公司)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒(江蘇碧云天公司)。Transwell小室(美國Corning公司)，Matrigel基質膠(美國BD公司)，NanoDrop 1000微量紫外可見分光光度計(德國 Eppendorf公司)，CFX96熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3RNA提取及RT-qPCR 采用苯酚-氯仿抽提法，按照Trizol試劑說明書從胃癌組織、血漿及胃癌細胞中提取總RNA，并用NanoDrop 1000微量紫外可見分光光度計檢測其濃度和純度，取吸光度(A260 nm/A280 nm)值為1.9～2.1的樣本用于后續試驗。按逆轉錄試劑盒說明書將RNA樣本逆轉錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。根據GenBank中的基因序列號，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，并送上海生工公司合成(表1)。根據SYBRRT-RT-qPCR Mixture試劑說明書配制體系，細胞、組織和血漿RT-qPCR體系：10 μL 2×PCR Mixture，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，1 μL模板cDNA，8.2 μL ddH2O。將上述體系置于ABI熒光定量PCR儀中檢測，循環參數：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s，共40次循環。72 ℃時采集熒光信號，使用7500 System Software-SDS 2.2軟件進行熔解曲線分析。細胞和組織以β-actin為內參基因，血漿以U6為內參基因。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4細胞轉染 復蘇胃癌AGS細胞，取1×105個細胞(每孔200 μL)鋪于12孔細胞培養板中，置于細胞培養箱(37 ℃、5% CO2)中培養，待其細胞密度達60%～80%時轉染。按照Lipofectamine 2000說明書操作，用無血清培養基配制轉染試劑及si-RNA工作液，試驗設2組，分別為：si-NPSR1-AS1組(50 μL無血清的 RPMI 1640 培養液+2 μL Lipofectamine2000+2 μL si-NPSR1-AS1)；si-NC組(50 μL無血清的 RPMI 1640培養液+2 μL Lipofectamine2000+ 2 μL si-NC)，分別混勻靜置20 min后進行轉染，4～6 h后更換為完全培養基繼續培養。

1.5細胞生長曲線 取上述轉染48 h后的AGS細胞(si-NPSR1-AS1組和si-NC組)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，重懸并計數，以每孔1×104個的細胞密度接種于12孔細胞培養板，每組設置6個復孔。置于細胞培養箱(37 ℃、5% CO2)中培養，培養基每3 d更換1次，每隔24 h在光學顯微鏡下拍照并計數，結果取均值，連續計數5 d，根據細胞數量繪制生長曲線，并計算細胞增殖能力。

1.6平板克隆形成試驗 取上述轉染48 h后的AGS細胞(si-NPSR1-AS1組和si-NC 組)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，重懸并計數，以每孔1×103個的細胞密度接種于6孔細胞培養板中，置于細胞培養箱(37 ℃、5% CO2)中培養，培養基每3 d更換1次。在培養后的第10天，將細胞用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定細胞30 min，0.5%結晶紫避光染色15 min，再用PBS清洗2～3次，待自然風干后，光學顯微鏡下觀察并計數大于30個細胞、集落大小為0.4～1.0 mm的克隆。

1.7Transwell 細胞遷移和侵襲試驗

1.7.1遷移試驗 取轉染48 h后的AGS細胞(si-NPSR1-AS1組和si-NC 組)，2.5 g/L胰蛋白酶消化，加入無血清培養基重懸并計數，調整細胞濃度為1×105/mL。然后以每孔200 μL接種于Transwell小室上室，下室中每孔加入750 μL完全培養基。培養24 h后，4%多聚甲醛固定細胞30 min，0.5%結晶紫染色15 min，棉簽擦去上室面殘余細胞，用熒光顯微鏡拍照并隨機計數10個視野(×100)的細胞數, 結果取均值。

1.7.2侵襲試驗 取無血清培養基44 μL和Matrigel 6 μL混合稀釋，滴入Transwell小室中包被上室膜，然后置于24孔細胞培養板中，置于培養箱溫育4 h。其余步驟同遷移試驗。

1.8細胞凋亡試驗 取上述轉染48 h后的AGS細胞(si-NPSR1-AS1組和si-NC 組)，1×Binding buffer重懸細胞，計數并加入PBS，調整細胞濃度為2×105/mL，依次加入10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI混合，避光靜置15 min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)。

1.9統計學分析 數據均采用SPSS 23.0軟件進行統計分析，GraphPad Prism 7.0軟件分析制圖。所有試驗均獨立重復3次，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。計數資料采用χ2檢驗。生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1NPSR1-AS1在胃癌組織及血漿中的表達 RT-qPCR結果顯示，86例胃癌組織標本中NPSR1-AS1的相對表達量(3.98±0.36)顯著高于癌旁組織(2.78±0.31)，差異具有統計學意義(t=2.51，P<0.05)。而21例胃癌患者血漿中NPSR1-AS1的相對表達量(4.35±0.39)亦顯著高于21例體檢健康者(2.51±0.50),差異具有統計學意義(t=2.89，P<0.01)。

2.2NPSR1-AS1在胃癌組織及血漿中的臨床應用價值 NPSR1-AS1在86例胃癌組織中相對表達量的中位數為0.913，以此為界將胃癌患者分為高表達組(n=43)和低表達組(n=43)。結合臨床病理資料，分析其與NPSR1-AS1表達量的關系，結果顯示NPSR1-AS1高表達與腫瘤大小(t=11.02，P<0.01)、淋巴結轉移(t=2.30，P<0.05)、腫瘤血管或神經侵襲(t=3.09，P<0.01)和TNM分期(t=3.55，P<0.01)密切相關。而與性別、年齡、是否吸煙、飲酒等無顯著相關性(表2)。Kaplan-Meier分析表明，NPSR1-AS1高表達組患者的生存率明顯低于低表達組(HR=2.58,95%CI:1.38～4.71,P<0.05,圖1A)。胃癌患者血漿NPSR1-AS1水平診斷胃癌的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.696，95%CI為0.534～0.858，當cut-off值為9.52時，特異性為90.5%，敏感性為47.6%。見圖1B。

注：A，NPSR1-AS1表達與胃癌患者生存率之間的相關性；B，血漿NPSR1-AS1表達水平的ROC曲線。

表2 胃癌患者組織中NPSR1-AS1的表達與臨床病理參數的關系

2.3NPSR1-AS1敲減后對AGS細胞生物學行為的影響 轉染AGS細胞48 h后經RT-qPCR結果證實，siRNA的敲減效率滿意，其表達量(1.03±0.01)與對照組(0.57±0.02)相比，下降了54.5%(t=18.92，P<0.05，圖2A)。細胞生長曲線及平板克隆形成試驗結果表明，NPSR1-AS1敲減后能抑制AGS細胞的增殖能力(t=2.789，P<0.05，圖2B；t=14.00，P<0.05，圖2C)。Transwell遷移和侵襲試驗結果表明，NPSR1-AS1敲減后能抑制AGS細胞的遷移及侵襲能力(t=25.45，P<0.05，圖2D)。流式細胞術檢測結果顯示，si-NPSR1-AS1凋亡(早期凋亡+晚期凋亡)比例為9.43%，明顯高于si-NC組的5.22%(t=21.45，P<0.001，圖2E)，表明NPSR1-AS1敲減可誘導AGS細胞的凋亡。

注：A，NPSR1-AS1敲減后在胃癌細胞中的表達水平；B、C,細胞生長曲線及平板克隆試驗檢測NPSR1-AS1敲減后對AGS細胞增殖能力的影響；D，Transwell試驗檢測 NPSR1-AS1敲減后對AGS細胞遷移及侵襲能力的影響；E，流式細胞術檢測NPSR1-AS1敲減后對AGS細胞凋亡的影響。**，P<0.01；***，P<0.001。

2.4NPSR1-AS1敲減后對腫瘤相關基因表達的影響 NPSR1-AS1敲減后，RT-qPCR檢測腫瘤相關基因結果顯示，與對照組相比，GSK-3β和E-cadherin的表達量(分別為1.86±0.05、1.59±0.06)明顯上調(t分別為16.15和10.17,P均<0.01)，而β-catenin、N-cadherin、Snail和MMP2的表達量(分別為0.71±0.05、0.70±0.08、0.39±0.07、0.23±0.04)顯著下調(t分別為4.869、3.77和9.372,P均<0.01)。

3 討論

研究發現，LncRNA可通過調控胃癌細胞增殖、遷移和凋亡等多種生物學行為，直接或間接干擾基因表達，在胃癌的發生、發展及預后中發揮重要作用[5]。本課題組發現的LINC01225[6]在胃癌組織中高表達，并促進胃癌細胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間質轉化(EMT)過程。Yang等[7]發現，LINC00665在胃癌中的表達下調，在胃癌進展過程中發揮抑制胃癌細胞的增殖并誘導其凋亡的作用。目前關于NPSR1-AS1的研究甚少，至今還未證實其在胃癌中的作用機制。為了探討NPSR1-AS1在胃癌中是否發揮促癌作用，本研究發現NPSR1-AS1在胃癌患者組織及血漿中的表達水平明顯升高，其高表達與胃癌患者腫瘤大小、淋巴結轉移、腫瘤血管或神經侵襲和TNM分期顯著相關，并且高表達患者的術后總生存率明顯降低，表明NPSR1-AS1在胃癌中發揮著促癌作用并導致其不良預后。筆者通過進一步的細胞功能試驗發現，NPSR1-AS1可促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，表明其能夠促進胃癌細胞的惡性生物學行為。

有學者發現，LncRNA可以通過靶向不同的分子標志物直接或間接地調節EMT過程，從而發揮促腫瘤作用[8]。而NPSR1-AS1能否也通過EMT實現這一過程目前尚不清楚。本研究發現，NPSR1-AS1敲減后GSK-3β和E-cadherin的表達上調，而β-catenin、N-cadherin、Snail和MMP2的表達下調，EMT相關基因變化明顯。有文獻顯示，GSK-3β是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在多種細胞活動中起關鍵作用，如細胞增殖、分化、凋亡和細胞周期等[9]。在多個信號通路中，如Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、Hedgehog、Notch等，GSK-3β均具有重要的中心樞紐作用，進而調控疾病的進展[10]。Wnt/β-catenin信號通路在EMT啟動過程中發揮重要的調控作用，該信號通路活化后可以通過抑制GSK-3β的活性,致使β-catenin不能被GSK-3β磷酸化，導致游離β-catenin大量入核，而β-catenin在核內可以作為轉錄因子的亞單位,從而誘導EMT的轉錄因子表達以激活EMT過程。相反，GSK-3β過表達后可以抑制EMT過程[11]。本研究結果證實，NPSR1-AS1敲減后GSK-3β水平上調，從而抑制了β-catenin及EMT信號。Zheng等[12]發現LncRNA MALAT1可以作為GSK-3β負調節劑，抑制GSK-3β表達以降低β-catenin活性，從而影響結腸癌細胞的惡性行為。因此，筆者推測NPSR1-AS1可能通過Wnt/β-catenin信號通路的激活，刺激幾種與EMT相關的轉錄因子，從而促進EMT過程。

本課題組在前期實驗發現，NPSR1-AS1在胃癌患者組織及血漿中的表達水平升高，且與胃癌的發生和轉移相關，本研究進一步探討了NPSR1-AS1對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，但未探究細胞周期等其他生物學行為的影響。此外，NPSR1-AS1可能通過調節GSK-3β的表達水平，從而調控Wnt/β-catenin信號通路以誘導腫瘤的EMT過程，但尚缺乏相關實驗進一步證明。在后續研究中，本課題組將進一步研究NPSR1-AS1如何調控GSK-3β的表達來影響胃癌細胞生物學行為的具體機制，以期為尋找新的胃癌治療靶標提供更多的實驗依據。