環狀RNA hsa_circ_002059在胃癌患者組織與循環血液中的表達及意義

李榮，江佳佳,2，錢暉，許文榮,2

(1.江蘇大學醫學院，江蘇省檢驗醫學重點實驗室，江蘇鎮江 212000；2.江蘇大學澳洋腫瘤研究院，江蘇張家港 215600)

胃癌是我國最常見惡性腫瘤之一，現階段急需發掘新的生物學標志物并建立方便、微創、靈敏和特異的診斷方法[1]。近年來研究發現，環狀RNA(circular RNAs，circRNAs)廣泛存在于人體各組織和體液(包括外泌體)中，種類與數量豐富，具有穩定性、物種保守性和組織、時序、疾病特異性，目前已成為最具前景的分子標志物[2]。此外，環狀RNA在多種疾病尤其是腫瘤中具有重要的調控作用，可作為miRNA分子海綿，通過堿基配對吸附miRNA，解除其對下游靶基因的抑制效應，具有作為新型治療靶點的潛在價值[3]。另有研究表明，環狀RNA與胃癌進展密切相關，可作為胃癌診療的新分子標志物[4]。因此，本研究建立檢測環狀RNA hsa_circ_002059表達的實時熒光定量RT-PCR法，并探討其在胃癌組織與外周循環血液中表達的臨床意義。

1 材料和方法

1.1主要試劑及儀器 miRNeasy 組織細胞RNA提取試劑盒、miRNeasy血漿RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)，HiScript逆轉錄試劑盒、AceQ定量PCR試劑盒、10×DNA上樣緩沖液、100 bp DNA Marker(南京諾唯贊公司)，ExoQuick血漿外泌體提取試劑(美國SBI公司)。NanoDrop ND-2000微量分光光度計(美國Thermo公司)，CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，GenoSens凝膠成像分析儀(上海勤翔儀器公司)。

1.2標本來源 收集于2015年4月至2016年11月在鎮江市第一人民醫院普外科初次確診為原發性胃癌患者的組織標本87例，其中男性63例，女性24例，年齡35～88歲，中位年齡66歲。納入標準：(1)經臨床醫師確診為原發性胃癌，組織病理切片經病理科醫師復核確認；(2)患者術前無放、化療等抗癌治療史。排除標準：(1)排除轉移和術后復發腫瘤以及胃良性腫瘤；(2)合并其他良惡性腫瘤；(3)伴有糖尿病、精神疾病、免疫疾病、肝腎功能不全、心衰等。收集于2017年1月至2018年6月在鎮江市第一人民醫院普外科初次確診為原發性胃癌術前患者的外周血樣本62例(其中10例血漿樣本因試驗過程中損失，丟失相應數據)，其中男性51例，女性11例，年齡38～85歲，中位年齡68歲。并收集同期年齡、性別匹配的體檢健康者62例，其中男性51例，女性11例，年齡38～85歲，中位年齡68歲。本研究通過江蘇大學醫學倫理委員會審核批準(批準文號：江大校[2020]161)，各研究對象均簽署知情同意書。

1.3組織及外周血標本采集 取上述經外科手術切除獲取的胃癌患者新鮮胃癌組織和距離腫瘤邊緣5 cm以上的鄰近癌旁組織，置于-80 ℃保存。以EDTA-K2真空抗凝管采集胃癌患者術前以及體檢健康者體檢時的空腹靜脈血2 mL，2 h內以4 ℃、3 000×g離心10 min分離血漿，以每管250 μL分裝至1.5 mL進口Ep管，置于-80 ℃保存。

1.4總RNA提取及cDNA合成 組織樣本采用液氮研磨法破碎，按照miRNeasy組織細胞RNA提取試劑盒說明書提取組織RNA。血漿樣本置于冰上融化，以4 ℃、3 000×g離心15 min，取上清液，按照miRNeasy血漿RNA提取試劑盒說明書提取血漿RNA。按每250 μL血漿加入63 μL ExoQuick血漿外泌體提取試劑、沉淀獲得血漿外泌體，再按照miRNeasy血漿RNA提取試劑盒說明書提取血漿外泌體RNA。采用NanoDrop ND-2000微量分光光度計測定RNA濃度與純度，選取吸光度(A260 nm/A280 nm)比值為1.8～2.0的樣本用于后續試驗，RNA樣本置于-80 ℃保存，避免反復凍融。按照HiScript逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，并置于-20 ℃保存。

1.5hsa_circ_002059與胃癌相關分析 登錄circ2Traits數據庫(http://gyanxet-bata.com/circdb/)首頁，選擇疾病類型為“胃癌”，預測hsa_circ_002059與胃癌有關的可能性。登錄starBase v2.0數據庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)首頁，輸入環狀RNA分子名稱“hsa_circ_002059”，分析hsa_circ_002059與胃癌相關miRNA的結合位點。

1.6引物設計及實時熒光定量RT-PCR擴增 參照參考文獻[5]，采用Primer Premier 5.0引物設計軟件，并使用NCBI Primer Blast數據庫分析設計引物，引物由美國Invitrogen公司合成。hsa_circ_002059(circBase ID：hsa_circ_0000140)上游引物序列：5′-CCCGATAACACAAGTGCAGC-3′，下游引物序列：5′-CCTGGACCTTCCACCTTCTC-3′，退火溫度為60 ℃，擴增產物長度為126 bp。內參基因β-actin(GeneBank ID：NM_001101.5)上游引物序列：5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物序列：5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′，退火溫度為60 ℃，擴增產物長度為265 bp。采用AceQ定量PCR試劑盒及CFX96實時熒光定量PCR儀進行實時熒光定量RT-PCR反應。PCR反應總體系為20 μL，含cDNA模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，2×qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，滅菌蒸餾水7.2 μL。PCR循環參數：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環；于60 ℃時采集熒光信號，使用儀器配套的CFX Manager軟件進行熔解曲線分析，并檢測PCR產物特異性。每個樣本設置3個復孔，設置固定閾值記錄Ct值，取3次PCR結果計算平均Ct值，采用相對定量法(-△Ct法)計算各樣本hsa_circ_002059的表達水平，公式：△Ct=Cthsa_circ _002059-Ctβ-actin。PCR產物以15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，于EB染料中染色15 min后置于凝膠成像儀中顯像并拍照。

1.7統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量資料不符合正態分布，以中位數(四分位數)[M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以ROC曲線分析評估hsa_circ_002059對胃癌的篩查價值，Kaplan-Meier 聯合log-rank檢驗分析生存時間。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1hsa_circ_002059與胃癌進展的關系 數據庫circ2Traits分析結果顯示，hsa_circ_002059與胃癌有關(P=0.000 000 48)。數據庫starBase v2.0分析結果顯示，hsa_circ_002059與9種miRNA(hsa-miR-3118、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-96-5p)具有結合位點，其中8種miRNA均被報道參與了調控胃癌進展過程[6-13]。

2.2hsa_circ_002059檢測的實時熒光定量RT-PCR法評價 采用熒光定量RT-PCR檢測胃癌組織、血漿和血漿外泌體中hsa_circ_002059的結果顯示，熔解曲線為單峰無雜峰，且擴增產物Tm值均一。陰性對照體系在擴增40個循環后仍未檢測出熒光信號。瓊脂凝膠電泳顯示擴增產物為單一條帶，且分子量符合理論大小。

2.3hsa_circ_002059在胃癌組織中的表達及臨床價值 實時熒光定量RT-PCR檢測結果表明，胃癌組織中hsa_circ_002059的表達水平[-8.60(-10.60，-6.81)]顯著低于癌旁組織[-4.47(-7.15，-3.18)]，差異有統計學意義(U=1 759.0，P<0.001)。以胃癌組織組為疾病組，以癌旁組織為對照組，繪制ROC曲線評估組織hsa_circ_002059對胃癌篩查效能，結果表明其ROC曲線下面積(AUCROC)為0.768(95%CI：0.690～0.845)，當cut-off值為-5.503時，其篩查胃癌的敏感性為0.67，特異性為0.92，見圖1A。

以cut-off值為界，將患者分為hsa_circ_002059高表達組(17例)和低表達組(70例)。胃癌組織中hsa_circ_002059低表達與較大的腫瘤體積有關(χ2=6.183，P=0.013)，見表1。生存曲線分析顯示，低表達hsa_circ_002059的胃癌患者具有較短的預后生存時間的趨勢(平均生存時間：27.8個月vs 33.3個月)，但差異無統計學意義(χ2=1.618，P=0.203)，見圖1B。

注：A，組織hsa_circ_002059篩查胃癌的ROC曲線；B，組織hsa_circ_002059高表達組和低表達組胃癌患者生存率的比較。

表1 胃癌組織中hsa_circ_002059的表達與患者病理參數的關系

2.4hsa_circ_002059在胃癌患者血漿及血漿外泌體中的表達與分析 熒光定量RT-PCR結果顯示，胃癌患者血漿中hsa_circ_002059表達量[-8.87(-10.51，-7.50)]較體檢健康者[-10.22(-10.72，-8.58)]顯著升高(U=1 011.5，P=0.027)。以胃癌患者為實驗組，體檢健康者為對照組，以ROC曲線評估血漿hsa_circ_002059對胃癌篩查的效能，結果顯示AUCROC為0.626(95%CI：0.518～0.734)，當cut-off值為-9.416時，其篩查胃癌的敏感性為0.65，特異性為0.64，見圖2A。

以cut-off值為界，將胃癌患者分為hsa_circ_002059高表達組(33例)和低表達組(19例)，結果發現胃癌患者血漿中hsa_circ_002059高表達與胃癌淋巴結轉移有關(χ2=12.231，P=0.005)，見表2。生存曲線分析顯示，血漿中高表達hsa_circ_002059的胃癌患者較低表達患者的預后生存時間顯著縮短(平均生存時間：34.5個月vs 45.8個月)，差異具有統計學意義(χ2=4.594，P=0.032)，見圖2B。熒光定量RT-PCR結果顯示，胃癌患者血漿外泌體hsa_circ_002059的表達水平[-9.84(-11.61，-4.95)]與體檢健康者[-9.84(-10.51，-7.83)]相比，差異無統計學意義(U=1 746.0，P=0.379)。

注：A，血漿hsa_circ_002059篩查胃癌的ROC曲線；B，血漿hsa_circ_002059高表達組和低表達組胃癌患者生存率的比較。

表2 胃癌血漿中hsa_circ_002059的表達與患者組織病理參數的關系

3 討論

近年來，許多環狀RNA被發現異常表達于腫瘤中且具有診斷與預后評估價值。如在肝癌組織中呈顯著高表達的hsa_circ_0128298可用于肝癌的輔助篩查(AUCROC為0.661)與不良預后的判斷[14]。本研究利用生物信息學預測確定hsa_circ_002059為胃癌相關環狀RNA，對其設計了特異性引物并建立了熒光定量RT-PCR方法，經驗證該方法可以用于檢測組織、血漿和外泌體中hsa_circ_002059的表達水平。

筆者進一步檢測發現，hsa_circ_002059低表達于胃癌組織(AUCROC達0.768)，顯著優于傳統的胃癌診斷標志物CEA、CA19-9、CA72-4(AUCROC分別為0.653、0.639、0.685)[15]，具有胃癌輔助篩查價值。此外，血漿中高表達hsa_circ_002059的胃癌患者相較于低表達患者的平均生存時間明顯縮短，故而hsa_circ_002059可用于胃癌患者不良預后評估。盡管Sun等[16]發現血漿中顯著低表達的has_circ_0000520可作為胃癌診斷標志物，其診斷效能顯著高于組織樣本檢測(AUCROC：0.897 vs 0.613)，且循環血液標本獲取僅需微創方法，比組織樣本獲取更具優勢。但本研究發現，血漿hsa_circ_002059用于胃癌輔助診斷的AUCROC為0.626，但血漿外泌體檢測未能區分胃癌患者與體檢健康者，且組織學檢測未能區分預后不良患者。因此，在輔助診斷中hsa_circ_002059的組織學檢測效能優于血漿和血漿外泌體檢測，而在預后評估中hsa_circ_002059的血漿檢測效能則優于組織學檢測。

此外，環狀RNA被證實與miRNA具有結合位點，可作為miRNA分子海綿，參與胃癌等腫瘤的生長、轉移過程。本研究發現，hsa_circ_002059具有多個胃癌相關miRNA的結合位點，可能通過miRNA分子海綿參與胃癌進展。進一步分析結果顯示，在胃癌組織中低表達的hsa_circ_002059與腫瘤大小有關，在胃癌患者血漿中高表達與淋巴結轉移有關，提示hsa_circ_002059與腫瘤進展相關。該分子在胃癌進展過程中的具體作用及機制有待進一步體內外實驗證實。盡管有研究顯示，環狀RNA在組織與循環血液中的表達水平相一致[17]。但本研究證實hsa_circ_002059在胃癌組織與血漿中的表達水平相反，與Lu等[18]報道的hsa_circ_0006633表達情況相似，其內在的分子機制有待于進一步揭示，可能與環狀RNA細胞分泌和清除機制有關。

綜上所述，hsa_circ_002059表達與胃癌進展有關，組織學和血漿樣本檢測有望用于胃癌輔助診斷與預后評估。在后續研究中，我們將深入探討其調控胃癌進展的作用和分子機制，并進一步擴大樣本量，驗證其對胃癌臨床診療的潛在應用價值。