應用流式細胞術輔助診斷神經母細胞瘤患兒骨髓侵犯

邢天禹，陳慧，高超，陳振萍，賀思豆，蘇雁，馬曉莉

(國家兒童醫學中心，首都醫科大學附屬北京兒童醫院 a.血液病中心，兒童血液病與腫瘤分子分型北京市重點實驗室，兒科學國家重點學科，兒科重大疾病研究教育部重點實驗室，北京市兒科研究所，血液疾病研究室，b.兒童腫瘤中心腫瘤內科，北京市兒童血液腫瘤重點實驗室，兒科重大疾病研究教育部重點實驗室，北京 100045)

神經母細胞瘤(neuroblastoma，NB)是一種起源于交感神經系統的惡性實體腫瘤，起病隱匿，易發生轉移。骨髓(bone marrow，BM)是NB最常見的轉移部位之一，患者預后較差[1-2]。骨髓細胞形態學結果是判斷NB骨髓轉移的金標準。近年來，隨著對NB標志物的深入研究，檢測方法逐漸豐富。有學者采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測配對同源異型盒蛋白2B(paired like homeobox 2B，PHOX2B)基因的表達[3]，證實其可以特異性高表達于神經源性細胞內，且在骨髓樣本中的檢測靈敏度可達10-5數量級，但同時存在操作過程復雜，對操作人員要求較高，易出現污染等問題，無法滿足臨床的迫切需求。

流式細胞術(flow cytometry assay，FCM)是一種快速、便捷的臨床常規檢測技術[4]。神經節甘脂(ganglioside 2，GD2)作為神經母細胞瘤表面特異性標志物和治療靶點[5]，近年來多項研究應用以標記GD2為主的多色組合方案FCM進行GD2檢測。然而，相關研究的檢測準確率均不同，且在大樣本量的兒童臨床檢測應用中的相關報道較少[6-7]。目前，對NB細胞的標記方案尚無統一標準。本研究擬采用CD45/CD56/CD81/GD2四色組合方案的FCM檢測120例NB初診患兒的骨髓樣本，并與骨髓細胞形態學結果進行比對，以期為臨床提供快捷、準確的檢測方法。

1 材料和方法

1.1研究對象 連續納入2019年6月至2020年6月首都醫科大學附屬北京兒童醫院腫瘤內科收治且確診的NB患兒，男64例，女56例，年齡2～187個月，中位年齡34.5個月。其中低危組33例，中危組38例，高危組49例。患兒診斷時行骨髓細胞學檢查，包括骨髓涂片和骨髓活檢免疫組化檢測，其中1項或全部結果陽性即可診斷為骨髓侵犯。患兒存在骨髓侵犯37例，無骨髓侵犯83例。NB診斷標準依據國家衛生健康委員會《兒童神經母細胞瘤診療規范》2019版[8]。納入標準：(1)病理診斷：腫瘤組織光鏡下明確診斷為NB；(2)臨床診斷：骨髓涂片或骨髓活檢顯示特征性NB細胞，伴有尿液(或血清)兒茶酚胺或其代謝產物明顯升高。具有以上任何1條即可入組。排除標準：對患嚴重的肝腎疾病，血液系統疾病，其他惡性腫瘤，自身免疫病以及經化療、放療或免疫治療的患兒予以排除。本研究經首都醫科大學附屬北京兒童醫院醫學倫理委員會批準(倫理文號：2017-k-54、2017-114)，并進行臨床注冊(注冊號：ChiCTR1800017940，2018-1-1)。NB患兒家屬均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 Peridinin葉綠素蛋白(PerCP)標記小鼠抗人CD45抗體、R-藻紅蛋白(PE)標記小鼠抗人CD81抗體(美國Miltenyi Biotec公司)，異硫氰酸熒光素(FITC)標記小鼠抗人GD2抗體、溶血素(美國BD公司)，異藻藍蛋白(APC)標記小鼠抗人CD56抗體(美國Beckman coulter公司)，高pH值抗原修復液、過氧化氫酶阻斷劑、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG抗體、DAB顯色液、兔抗人Protein Gene Product 9.5抗體(protein gene product 9.5，PGP9.5)、兔抗人突觸素抗體(synaptophysin，Syn)、兔抗人嗜鉻素A抗體(chromogranin A，CgA)均購自北京基因科技公司，蘇木素染液、伊紅染液、分化液、返藍液(北京九州柏林生物科技公司)，瑞氏染色劑(珠海BASO公司)。NAVIOS流式細胞儀、Kaluza分析軟件(美國Beckman coulter公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集 NB患兒在診斷初期，于髂骨位置取骨髓液制作至少2張骨髓涂片。另采集2 mL骨髓液置于肝素抗凝管中，迅速顛倒混勻，2 h內進行FCM檢測。相同部位取直徑2 mm，長度1.5～2.5 cm的骨髓組織，外觀可見白色的骨皮質和紅色的骨髓質，置于10%福爾馬林固定液中保存。

1.3.2FCM 取上述各NB患兒的骨髓樣本，分別設立1個對照管和1個試驗管，各管分別加入PerCP標記小鼠抗人CD45抗體10 μL、APC標記小鼠抗人CD56抗體5 μL，對照管加入對照試劑1 μL，FITC標記小鼠抗人IgG1和2 μL APC標記小鼠抗人的IgG1，試驗管加入2 μL FITC標記小鼠抗人GD2抗體和1 μL APC標記小鼠抗人CD81抗體。各管分別加入150 μL骨髓樣本，震蕩混勻，室溫避光溫育20 min。每管加入溶血素工作液(1∶9稀釋)2 mL，振蕩混勻，避光靜止10 min。700×g離心5 min，棄去上清，加入2 mL PBS震蕩混勻。重復離心，PBS洗滌2次，棄去上清，加入150 μL PBS，24 h內上機檢測。利用前向角散射光(FSC)設門去除粘連細胞，以CD45和CD56設門圈出CD45-CD56+細胞群，再以CD81和GD2設門圈出CD81+GD2+細胞群(NB細胞)。采用Kaluza流式細胞儀分析軟件分析細胞免疫表型，以CD45陰性、CD56陽性、CD81陽性、GD2陽性的細胞群定義為NB細胞，并計算NB細胞在全部有核細胞中所占的百分比。

1.3.3骨髓細胞形態學

1.3.3.1骨髓涂片檢測 每例患者取至少2張骨髓涂片，瑞-吉氏染色后鏡檢。常規計數200個有核細胞，以觀測到異常菊花團樣腫瘤細胞定義為NB骨髓侵犯。涂片采用HE染色，經二甲苯和梯度乙醇(100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇)脫蠟、脫水。蘇木素染色5 min。常規透明、脫水、封片后鏡檢。

1.3.3.2骨髓免疫組化檢測 骨髓標本用10%福爾馬林固定液固定、石蠟包埋，切成4 μm厚切片，經二甲苯和梯度乙醇(100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇)脫蠟、脫水，PBS洗滌3次，每次5 min。切片在抗原修復液中高壓、煮沸5 min以修復抗原。濕盒內加入內源性過氧化氫酶阻斷劑避光溫育15 min，以抑制內源性過氧化物酶活性。PBS洗滌3次，每次5 min。加入兔抗人PGP9.5、CgA、Syn一抗工作液(1∶200稀釋)置于濕盒中溫育50 min，PBS漂洗3次，滴加辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG抗體(1∶1 000稀釋)，室溫溫育20 min，PBS漂洗3次，滴加3,3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色液，蘇木素復染、透明、常規脫水、封片。以PBS替代一抗作為陰性對照。每張切片選取5個高倍鏡視野(×400)，以顯色為褐色的細胞為陽性細胞。

1.4統計學分析 采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，一致性分析采用Kappa檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義，以Kappa≥0.80為兩者一致性強。

2 結果

2.1FCM檢測與骨髓活檢結果的比較 骨髓細胞形態學結果陽性為37例，陰性83例；FCM結果陽性35例，陰性85例。骨髓活檢及骨髓免疫組化檢測結果見圖1、2。FCM檢測結果見圖3。

注：A,NB骨髓侵犯；B,無NB骨髓侵犯(HE染色，×400)。

2.2FCM檢測與骨髓活檢結果的一致性評價 細胞形態學陽性組FCM檢測的準確率為91.8%(34/37)。細胞形態學陰性組FCM檢測的準確率為98.7%(82/83)。見表1。FCM檢測結果和骨髓細胞形態學檢測結果的一致性較強(Kappa=0.921，P<0.001)。

表1 120例NB患兒FCM檢測與骨髓細胞形態學結果的一致性評價

3 討論

FCM是臨床檢驗重要的技術之一，其優勢在于操作便捷，靈敏度可達0.01%[9-10]。Nagai等[11]發現，在NB細胞膜上CD81的表達水平高于CD9，應用CD45/CD56/CD81方案比CD45/CD56/CD9方案標記NB更具有特異性和靈敏性。雖然CD81在NB細胞上呈強陽性表達，但其研究可能存在漏洞，本研究發現在明確無骨髓轉移樣本中均有CD81的表達，因此，單獨使用CD45/CD56/CD81方案在臨床檢測中是不可行的。湯永民等[6]應用CD45/CD56/GD2方案檢測結果顯示，13例初診病例的骨髓檢測結果與病理檢查診斷結果的符合率達92%。Manenq等[10]采用CD45/CD56/GD2/CD81/CD9/CD90多色方案檢測45例NB樣本，結果證實，其與免疫組織化學結果比較的準確率為80%。然而，該方案需采用多種標記，在操作時需要設立多個對照管，難以應對大量的待檢測樣本。目前，對NB細胞的標記方案尚無統一標準。

本研究采用CD45/CD56/CD81/GD2四色方案的FCM,利用特異性高的CD81和GD2抗體標記NB細胞，更有利于臨床檢測。本研究結果顯示，37例初診伴有NB侵犯的FCM結果與骨髓細胞形態學結果的符合率為91.8%，與文獻[6]結果基本一致，進一步證實了該方案的準確性。82例無NB侵犯的FCM結果與骨髓細胞形態學結果的符合率為98.7%，其中1例形態學陰性，但FCM陽性的患兒結合基因結果考慮NB低程度浸潤，也提示該方案具有較高的檢測靈敏度。

綜上所述，CD45/CD56/CD81/GD2四色組合方案的FCM能夠快速檢測NB骨髓侵犯，具有良好的特異性和靈敏度。然而，本研究僅入組診斷初期的NB患兒，未對在治療過程中的患兒骨髓進行評估，還需要后續研究以進一步分析。