用Ion Torrent半導體測序技術對血友病B家系F9基因行突變分析及產前診斷

劉安，馬定遠，劉剛，林穎，李璃，許爭峰，鐘天鷹

(南京醫科大學附屬婦產醫院&南京市婦幼保健院a.產前診斷中心，b.檢驗科，南京210004)

血友病B(hemophilia B, HB)是一種X連鎖隱性遺傳性出血性疾病，其發病機制為凝血因子Ⅸ(coagulation factor Ⅸ, FⅨ)的編碼基因F9缺陷所導致的凝血功能障礙[1]。在男性人群中HB的發病率為1/30 000；女性血友病患者罕見，通常為攜帶者[2]。根據癥狀的輕重及凝血因子Ⅸ活性(factor Ⅸ coagulant activity, FⅨ:C)，臨床上將HB分為輕型(FⅨ:C 5%～40%)、中型(FⅨ:C 1%～5%)和重型(FⅨ:C<1%)。HB的主要表現為出血，出血部位為皮膚黏膜、關節、肌肉及深部組織器官，可危及生命[3]。目前臨床上尚無有效的根治方法，患者主要以輸注FⅨ制劑或新鮮全血的替代治療為主。因此，開展F9基因診斷、攜帶者篩查及產前診斷具有重要的臨床應用價值[1,3]。本研究應用Ion Torrent半導體測序技術對11個HB家系進行F9基因突變分析，以期明確遺傳病因，為進一步指導妊娠提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2014年2月至2018年10月于南京市婦幼保健院遺傳咨詢及產前診斷門診就診的11個HB家系，其中家系3有3例患者。13例患者在本院或者外院診斷為HB，其中11例患者在本院進行了基因診斷，其余2例患者在外院進行基因診斷。對11個家系中的女性成員進行攜帶者篩查，并為7個家庭提供了產前診斷。家系成員非近親結婚，染色體核型和微陣列檢測未發現染色體結構異?；蚩截悢底儺?，并對其進行Ion Torrent半導體測序檢測以尋找致病基因及位點。本研究獲得南京市婦幼保健院醫學倫理委員會批準(寧婦倫字[2019]-KY086)，患者本人或患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2主要儀器及試劑 Lab-Aid 820核酸提取儀(廈門致善公司)，ABI A3500Dx基因分析儀(美國Applied Biosystems公司)。血液DNA提取試劑盒(美國Omega公司)，Lab-Aid核酸(DNA)分離試劑盒(廈門致善公司)，21-三體和性染色體多倍體檢測試劑盒(廣州達安基因公司)。Ion AmpliSeq Library Kit 2.0試劑盒、Ion PGM Sequencing 200試劑盒、Ion OneTouch系統、Ion Torrent 316芯片及Ion Torrent PGM測序儀均由美國Life technologies 公司提供，Sanger測序試劑和配套儀器由美國Applied Biosystems公司提供，PCR擴增試劑購自南京諾唯贊公司，SALSA mLPAPO95染色體非整倍體檢測試劑盒(荷蘭MRC Holland公司)。

1.3標本采集和DNA提取 采集所有受檢者就診時EDTA-K2抗凝的新鮮靜脈血2 mL；按照全血DNA提取試劑盒說明書提取外周血基因組DNA；采用羊膜腔穿刺術采集胎兒羊水樣本10 mL，2 000×g離心，PBS洗滌2次，按照Lab-Aid核酸(DNA)分離試劑盒說明書提取胎兒羊水細胞DNA。所得樣本濃度均>10 ng/μL，總DNA量>2.0 μg，吸光度(A260/A280 nm)值為1.8～2.0，外周血、羊水細胞沉淀與基因組DNA樣本均置于-20 ℃保存。

1.4羊水標本母體污染檢測及胎兒性別鑒定 按照21-三體和性染色體多倍體檢測試劑盒說明書擴增胎兒及其父母基因組DNA，擴增產物經A3500Dx基因分析儀進行毛細管電泳，對7個STR位點(D21S11、D21S1411、D21S1435、DXS6809、DXS981、X22和AMXY)進行分析，排除母體DNA污染并確定親源關系。采用SALSA MLPA P095染色體非整倍體檢測試劑盒對胎兒基因組DNA進行多重連接依賴探針擴增(multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA)分析，參考文獻[4]進行數據分析以判斷胎兒性別。

1.5Ion Torrent半導體測序 Ion Torrent半導體測序參照本實驗室建立的方法[5]進行。文庫構建：采用Ion AmpliSeq Library Kit 2.0試劑盒進行文庫構建，對擴增產物加入序列標簽及測序接頭，制備的文庫平均片段大小約為300 bp；乳液PCR和ISPs富集：采用Ion PGM Xpress Template 200試劑盒在Ion OneTouch系統上進行乳液PCR，對模板陽性磁珠顆粒(Ion Sphere Particles，ISPs)在Ion OneTouch ES模塊上進行富集；Ion Torrent測序：采用Ion PGM Sequencing 200試劑盒及Ion Torrent 316芯片在Ion Torrent PGM測序儀上進行測序，用Ion Torrent Suite v3.0軟件進行數據提取、參考基因組(UCSC hg19)序列比對及SNVs和Indels提取。

1.6生物信息學分析 通過dbSNP137(http://www.bioinfo.org.cn/relative/dbSNP%20Home%20Page.htm)、Genome Aggregation Database(http://gnomad-old.broadinstitute.org/)、the 1000 Genomes Project(http://www.internationalgenome.org/)等數據庫獲得變異的最小等位基因頻率，SIFT(http://sift.jcvi.org/)、Mutation Taster(http：//www.mutationtaster.org)、Polyphen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)及CADD(http：//cadd.gs.washington.edu/等軟件進行危害性預測，再結合HGMD、NCBI等數據庫[6]，根據美國醫學遺傳學與基因組學學會(ACMG，2015)分級標準[7]對突變位點進行致病性判斷。

1.7Sanger測序 對F9基因(NM_000133.4)突變位點進行家系驗證。使用NCBI在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計PCR引物，由蘇州金唯智公司合成，引物序列見表1。PCR反應體系為50 μL，包括25 μL PCR mix，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。循環參數：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min，共35個循環。PCR擴增產物送蘇州金唯智公司測序驗證。

表1 Sanger測序驗證引物序列

2 結果

2.1各HB家系基因突變檢測結果 13例HB患者均存在F9基因致病性突變，共發現10種突變，其中錯義突變7種，無義突變2種，整碼突變1種。Sanger 測序結果與高通量測序結果完全一致，結果見圖1?；谙茸C者的突變位點，對11個家系中的20名女性受檢者進行攜帶者篩查檢測，其中15例女性為F9基因突變攜帶者，其突變類型及檢測結果見表2。

表2 11例家系HB患者及女性成員F9基因突變檢測結果

注：A，患者P1a的Sanger測序結果，箭頭示c.128G>A突變；B，患者P2a的Sanger測序結果，箭頭示c.128G>A突變; C，患者P3a的Sanger測序結果，箭頭示c.190T>C 突變; D，患者P4a的Sanger測序結果，箭頭示c.343T>C突變; E，患者P5a的Sanger測序結果，箭頭示c.356G>A突變;F，患者P6a的Sanger測序結果，箭頭示c.454A>T突變; G，患者P7a的Sanger測序結果，箭頭示c.677G>A突變; H，患者P8a的Sanger測序結果，箭頭示c.688G>A突變; I，患者P9a的Sanger測序結果，箭頭示c.892C>T突變; J，患者P10a的Sanger測序結果，箭頭示c.1220G>A突變; K，患者P11a 的Sanger測序結果，箭頭示c.1130_1132del突變。

2.2產前診斷結果 依據F9基因檢測結果，對7個家系中的高危胎兒進行產前診斷，其中為6個家庭提供了1次產前診斷，1個家庭孕婦兩次妊娠，并提供了2次產前診斷，羊膜腔穿刺術后無出血、感染、流產及胎死宮內等并發癥。8例胎兒中1例為半合子突變，判斷其罹患HB，經遺傳咨詢，胎兒家屬選擇終止妊娠。2例為雜合突變，為HB女性攜帶者，5例不攜帶母源致病突變，為正常胎兒。

3 討論

人F9基因定位于Xq27.1，全長約為34 000 bp，由8個外顯子和7例內含子組成，編碼461個氨基酸的FⅨ[8]。F9基因突變類型多種多樣，且無明顯的突變熱點，其中點突變占73.1%，其中單個堿基的突變約占80%，點突變的錯義突變約占64%，無義突變約占15 %[9]。

在本研究中，13例HB患者共發現10種突變，其中錯義突變7種，無義突變2種，整碼突變1種，錯義突變發生率占70%，是F9基因的主要突變方式，與文獻[9]報道的結果基本相符。本研究發現有3種突變發生在第8外顯子，約占30%，該區域發生突變的頻率較高，提示第8外顯子是FIX基因的突變高發區[10]，P10a患者c.1220G>A導致407位上的半胱氨酸被酪氨酸取代，P11a患者c.1130_1132del使377位上的纈氨酸缺失，突變均發生在絲氨酸蛋白酶催化區域，使FIX蛋白催化活性降低，影響其在FX向FXa的轉化中發揮功能，而P9a患者c.892C>T導致298位上的精氨酸突變為終止密碼子，使FIX蛋白多肽鏈合成提前終止，無義突變產生縮短的蛋白質分子不能進入血液循環。此外，第2外顯子編碼前肽區域，通過形成谷氨?；然傅慕Y合位點觸發γ-羧基谷氨酸區(GLA區域)的羧化，進而形成與磷脂結合的部位；第4外顯子編碼與鈣離子結合的表皮樣生長因子1區(EGF-1區域)部位，第2號、第4號外顯子突變發生率也稍高[11]。本研究發現，有3種(30%)突變類型發生在CpG位點，這進一步證實了CpG二核苷酸是人類生殖細胞FIX熱點突變位點[9]。同時，筆者還發現有3種(30%)突變類型導致精氨酸密碼子發生改變，這可能是由于精氨酸密碼子中的胞嘧啶因甲基化容易發生脫氨基作用，變成胸腺嘧啶或腺嘌呤，從而導致精氨酸突變為其他類型的氨基酸[12]。然而，由于本研究中的樣本量較少，無法進行HB臨床表型與基因型的相關性分析，需要后期在更大樣本量的研究中進行分析驗證。

經數據庫檢索，筆者發現1種新突變(c.343T>C, p.Tyr115His)，且未見文獻和數據庫報道，該位點不位于CpG二核苷酸。PolyPhen軟件和SIFT 軟件預測該突變表型均為有害突變。同一位點多個其他類型的突變(p.Tyr115Asn，p.Tyr115Ser和p.Tyr115Cys)被報道可致病[13-15]。根據ACMG原則，判定該突變為可疑致病突變位點。根據家屬要求，基于此突變位點進行產前基因檢測，發現胎兒不攜帶該突變，選擇繼續妊娠，在后續的隨訪中新生兒表型無異常。研究發現，約10%～15%的F9基因突變女性攜帶者也可表現出血癥狀，這主要是由于女性的1條X染色體隨機失活導致的[16]。在本研究的15例女性F9基因突變攜帶者中，有1例(6.7%，1/15)表現為HB癥狀。有血友病癥狀的女性F9基因突變攜帶者比例略低于其他文獻報道，這可能與本研究中樣本量較少有關。

基于Ion Torrent半導體測序技術具有簡便、快速、通量大的優勢，可有效檢測出點突變和微小缺失重復，再對檢測出的致病突變用Sanger測序進行驗證，可建立有效可靠的F9基因檢測方法，便于臨床應用及推廣。本研究中的13例HB患者經基因測序均發現F9基因突變的存在，并發現了F9基因新的突變類型。綜上所述，本研究不僅豐富了F9基因的突變譜，還對臨床進行F9基因突變的攜帶者的產前診斷具有一定的指導意義。