基于網絡藥理學的黃芪免疫調節機制

趙珈華，劉 洋，桂金秋，石學魁，唐小云

(牡丹江醫學院病原生物學教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

網絡藥理學通過建立數據分析庫，構建網絡平臺分析數據庫提取信息以及采用相關軟件分析數據，獲得藥物-靶點-疾病信息網絡，最終獲得藥物的藥理活性和毒性活性，以及對疾病的作用機制。網絡藥理學從2007年首次明確概念[1]，發展至今已成為藥物分析的有力助手。2008年又將網絡藥理學引入中藥的活性挖掘[2]，現已成功應用于中醫藥領域研究。與傳統方法相比，網絡藥理學在探索中草藥活性成分作用機制方面更勝一籌[3]。

黃芪是豆科植物膜莢黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)或蒙古黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)的干燥根[4]。初載于《神農本草經》，現收錄于《中華人民共和國藥典》，性甘，微溫，入肺脾經，具有補氣升陽、益氣養血之功能，為臨床常用補益藥用植物，多用于治療氣虛乏力、尿少水腫和癰膿瘡潰[5]。目前研究顯示黃芪含有黃酮、多糖、皂苷、氨基酸、微量元素等多種活性成分[4]，具有增強免疫力[6]、抗衰老[7]、輔助抗癌[8]、護肝[9]的作用等。黃芪應用廣泛，被稱為中草藥中的“補藥之長”[10]。本研究通過網絡藥理學方法構建“中藥-成分-靶點-疾病”網絡，分析黃芪免疫調節作用的活性成分及相應作用靶點，探討其可能的免疫調節作用機制，為進一步的研究和應用打下一定的基礎。

1 資料與方法

1.1 黃芪有效成分及靶點的篩選采用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[11]輸入關鍵詞“黃芪”或“HuangQi”檢索黃芪的所有藥效化學成分，根據口服生物利用度(OB≥30%)以及化合物類藥性(DL≥0.18)篩選黃芪的有效成分，并利用TCMSP 檢索獲得的活性成分，獲取其有效成分對應靶點，將靶點通過UniProt 數據庫(https://www.uniprot.org)注釋為標準基因名稱，即為黃芪有效成分與作用靶點。

1.2 免疫調節相關基因靶點的篩選將“Immunoregulation”作為檢索詞輸入GeneCards 數據庫(https://www.genecards.org)檢索免疫調節的相關基因靶點。

1.3 黃芪-免疫調節“中藥-成分-靶點-疾病”可視化網絡的構建選用R包(VennDiagram包)通過RStudio(版本1.4.1103)將免疫調節基因靶點與黃芪基因靶點取交集，得到Venn圖和交集靶點信息文本。將黃芪活性成分與其對應靶點信息文本和免疫調節基因與黃芪基因交集靶點信息文本導入Cytoscape(版本3.7.2)構建黃芪-免疫調節“中藥-成分-靶點-疾病”網絡。

1.4 黃芪-免疫調節的PPI網絡構建、核心基因篩選將黃芪有效成分的免疫調節靶點導入String數據庫平臺(http://string-db.org)，選擇“Multiple proteins”，設置物種為“Homo sapiens”，其余參數保持默認值設置，構建蛋白互作網絡(Protein-protein interaction network，PPI)，將String平臺分析結果導出的string_interactions.tsv文件導入Cytoscape(版本3.7.2)篩選黃芪-免疫調節的核心基因。

1.5 黃芪-免疫調節基因富集分析將篩選出來的交集關鍵靶點基因通過RStudio(版本1.4.1103)選用R包(clusterProfiler包)進行GO基因富集分析和KEGG 通路富集分析，并分別使用R語言命令繪制出兩種富集分析的柱狀圖和氣泡圖，以探討黃芪有效成分免疫調節靶點蛋白在基因功能及信號通路中的作用。

1.6 統計學方法使用RStudio(版本1.4.1103)通過R包(Bioconductor包)對GO富集分析以及KEGG富集分析數據分別進行處理，設置PvalueCutoff=0.05、QvalueCutoff=0.05為顯著性差異限定值。

2 結果

2.1 黃芪活性成分以及靶點篩選通過TCMSP數據庫，共得到化合物成分20個，對應的靶點462個。應用UniProt數據庫對靶點基因進行標準化注釋，最終得到活性成分17個，相應靶點基因450 個,見表1。

表1 黃芪活性成分

2.2 免疫調節相關基因靶點的篩選通過Genecards網站選用“Immunoregulation”作為檢索詞，檢索到免疫調節相關基因569個，篩選其中RelevanceScore>1的免疫調節基因，最終篩選結果為267 個。

2.3 黃芪-免疫調節“中藥-成分-靶點-疾病”網絡的構建應用VennDiagram包對免疫調節基因靶點與黃芪有效成分基因靶點取交集，得到黃芪-免疫調節共同靶點42個(見圖1)。

圖1 免疫調節相關靶點與黃芪有效成分作用靶點的Venn圖

應用Cytoscape軟件(版本3.7.2)，將42個黃芪-免疫調節共同靶點構建“中藥-成分-靶點-疾病”的網絡模型(見圖2)。結果顯示，黃芪的12種有效成分協同作用于42個免疫調節靶點，其中槲皮素(MOL000098)擁有最多的對應靶點，達41個；山柰酚(MOL000422)、刺芒柄花素(MOL000392)、異鼠李素(MOL000354)、毛蕊異黃酮(MOL000417)分別含有15、4、3、2個靶點，說明槲皮素可能在免疫調節作用過程中起到關鍵作用，反映了黃芪免疫調節活性的多成分、多靶點的特點。

圖2 “中藥-成分-靶點-疾病”網絡圖

2.4 黃芪-免疫調節PPI網絡構建、核心基因篩選在String數據庫構建42個共有靶點的PPI網絡(見圖3)，共42個靶點和454條連線參與了PPI 網絡，454條連線代表了蛋白之間相互作用。將String數據庫分析結果的string_interactions.tsv文件導入Cytoscape(版本3.7.2)，應用軟件tools中的Network Analyzer對文件數據進行可視化分析(見圖4)。線條越粗代表combined-score越高，線顏色偏向橙紅色代表關聯度越強。節點越大代表combined-score越高，顏色越偏向橙紅色代表作用越強。應用RStudio(版本1.4.1103)分析string_interactions.tsv，繪制黃芪免疫調節關鍵靶點基因-鄰接基因連線數目柱狀圖(見圖5)。基因與鄰接基因連線的數目越多，越可能為網絡調控核心基因，說明其在網絡中的作用越大，很可能是黃芪藥效發揮的關鍵靶點。

圖3 免疫調節靶點PPI網絡

圖4 Cytoscape分析PPI網絡

圖5 黃芪-免疫調節關鍵靶點基因-鄰接基因連線數目柱狀圖

2.5 黃芪-免疫調節GO功能富集分析選用R語言的clusterProfiler 工具包[12]，將GeneSymbol 轉換為geneID，并對獲取的基因進行GO 富集分析，以P<0.05 &Q<0.05進行篩選，獲取74個GO 條目，對排名靠前的20個條目繪制柱狀圖(見圖6)和氣泡圖(見圖7)。結果顯示，免疫調節靶點主要富集在細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、信號受體激活劑活性、生長因子受體結合、生長因子活性、半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡信號通路、腫瘤壞死因子受體超家族結合、趨化因子活性等方面。

圖6 GO功能富集分析柱狀圖

圖7 GO功能富集分析氣泡圖

2.6 黃芪-免疫調節KEGG通路富集分析選用R的clusterProfiler工具包[12]，將GeneSymbol轉換為geneID，并對獲取的基因進行KEGG通路富集分析，以P<0.05 & Q<0.05篩選出126條信號通路，排名前20的通路信息見表2，對前20個通路繪制柱狀圖(見圖8)和氣泡圖(見圖9)。結果顯示，黃芪免疫調節靶點主要富集于糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、瘧疾(Malaria)、乙型肝炎(Hepatitis B)、查加斯病(Chagas disease)、甲型流感(Influenza A)、流體剪應力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、肺結核(Tuberculosis)、弓形蟲病(Toxoplasmosis)、人巨細胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)、丙型肝炎(Hepatitis C)等信號通路，提示黃芪有效成分可能通過多條信號通路發揮免疫調節作用。

圖8 KEGG通路富集分析柱狀圖

圖9 KEGG通路富集分析氣泡圖

表2 KEGG通路富集分析潛在相關通路靶點

3 討論

中藥黃芪單獨應用或與其他藥物聯合應用具有免疫調節活性[13-14]，但是具體作用機制研究相對較少。本研究通過網絡藥理學方法篩選出17個黃芪的有效活性成分，預測了267個潛在相關免疫調節基因靶點。通過構建“中藥-成分-靶點-疾病”的可視化網絡圖，發現黃芪免疫調節活性具有多靶點、多成分的特點。黃芪免疫調節的有效成分包括槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素、異鼠李素、毛蕊異黃酮、梔子醇、聯苯雙酯、黃芪異黃烷苷、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、黃芪紫檀烷苷、3,9-di-O-methylnissolin、7-O-methylisomucronulatol，其中大部分有效成分屬于黃酮類化合物，如槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素、異鼠李素、毛蕊異黃酮等；部分屬于烷基多糖苷類化合物，如黃芪紫檀烷苷、黃芪異黃烷苷等。這12種化合物協同作用于42個免疫調節的靶點基因，其中槲皮素可作用于41個靶點，山柰酚作用于15個靶點，異鼠李素作用于4個靶點，刺芒柄花素作用于3個靶點，其余成分僅作用于1～2個靶點。與在中國知網上檢索出的近幾年文獻幾乎相一致，黃芪的黃酮類化合物和烷基多糖苷類化合物具有顯著的免疫調節作用[15-16]。表明黃芪能夠通過12個有效成分作用于多個靶點發揮免疫調節作用。PPI 網絡分析的結果可以看出，TNF、IL-4、CXCL-8、IL-6、ICAM-1、AKT-1、TP53、VEGFA等因子與炎癥、趨化、黏附、凋亡等有關，可能是黃芪免疫調節的核心靶點。其中，TNF、IL-6是重要的免疫調節因子，參與疾病發生發展過程中的免疫調節，SUN等[17]通過等研究發現獺兔在灌胃玉屏風散后，其脾淋巴細胞促炎癥因子TNF和抗炎因子IL-4的mRNA表達均提高，同時發現血清中IL-4和TNF分泌增強。王潤田等[18]發現給外周血免疫細胞加入黃芪提取物可刺激細胞分泌TNF-α和IL-6。IL-4對遲發型超敏反應有著重要調節作用，朱艷平[19]應用ELISA檢測發現玉屏風散可調節Th1/Th2平衡，使IL-4表達水平降低，從而緩解IV型超敏反應。提示這些靶點是黃芪藥效成分發揮免疫調節的關鍵部位。為了研究黃芪有效成分免疫調節靶點在基因功能和信號通路中的作用，本研究將42個免疫調節靶點進行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。GO 分析結果顯示，黃芪有效成分主要富集在細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、信號受體激活劑活性、生長因子受體結合、生長因子活性、參與凋亡信號通路的半胱氨酸型內肽酶活性、腫瘤壞死因子受體超家族結合、趨化因子活性等方面；而KEGG通路分析發現與黃芪免疫調節作用密切相關的通路有126條，主要包括糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、瘧疾通路、乙型肝炎通路、查加斯病通路、甲型流感通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路等。本研究發現黃芪能夠作用于TNF信號通路靶點當中的CASP-3、NFκB、IFN-γ、TNF、Akt、CASP-8、IL-6、ICAM-1，表明黃芪可調控TNF通路發揮免疫調節作用。在TNF通路中，腫瘤壞死因子與特異性受體結合可以激活多條細胞通路，調控細胞凋亡、炎癥反應等。王潤田等[18]發現黃芪提取物可提高外周血淋巴細胞分泌TNF-α 的量，增強對腫瘤細胞的吞噬。這與本研究中KEGG通路富集分析在TNF 信號通路的結論是相吻合的。通過PPI網絡、GO、KEGG分析可以看出黃芪通過多靶點調控多通路發揮免疫調節作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法探討黃芪免疫調節作用的有效成分、相關靶點及相關信號通路，為進一步研究黃芪免疫調節活性的作用機制提供了一定的理論基礎，為黃芪的進一步臨床應用提供科學依據。