截短型轉化生長因子β II型受體對急性肝損傷小鼠炎癥因子表達的影響

黃 珍，王小花，初彥輝，劉海峰

(牡丹江醫學院 1.醫藥研究中心；2.基礎醫學院，黑龍江 牡丹江 157011)

肝臟是人體代謝的重要器官，具有儲存肝糖和合成分泌性蛋白質等重要功能。四氯化碳(CCl4)可誘導急性肝損傷，誘發炎癥并持續性損傷肝臟，進而發展為肝硬化等多種慢性肝臟疾病，最終造成肝臟功能紊亂[1-2]。因而，急性肝損傷是影響肝功能的主要因素[3-4]，研發防治急性肝損傷的藥物對于維持正常的肝功能具有重要意義。課題組前期研究表明：截斷型的轉化生長因子β II型受體(tTβRII)可通過有效抑制TGF-β1功能而緩解慢性肝損傷[5]，但其對急性肝損傷炎癥細胞因子的影響尚未見報道。因此，本研究以注射CCl4誘導的小鼠急性肝損傷動物為研究對象，探討tTβRII對急性肝損傷炎癥指標的影響，為急性肝損傷疾病的治療提供實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器四氯化碳(美國Sigma公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶公司)；兔抗鼠的TNF-α和IL-1β一抗(美國Proteintech公司)；羊抗兔的Ig G二抗(北京碧云天公司)；DAB顯色試劑盒(北京金杉公司)；RNA抽提試劑盒(美國Omega公司)；逆轉錄試劑盒SYBR Green Master(美國Roche公司)；TNF-α和IL-1β PCR引物(蘇州金唯智公司)；重組tTβRII由本實驗室制備；熒光定量PCR儀(美國ABI公司)和光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 急性肝損傷動物模型的制備和處理 SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，體重18～22 g，由牡丹江醫學院動物中心提供，動物合格證號：SCXK(黑)2019-003，飼養期間動物自由進食飲水，動物房光照節律12 h：12 h，適應1周后開始實驗。將20只小鼠隨機分為4組，隨機分為空白對照組(control)、模型組(CCl4)、模型對照組(CCl4+PBS)和tTβRII處理組(CCl4+tTβRII)，每組5只。control組為每日9:00直接腹腔注射200 μL純橄欖油，1次/d，共4 d。CCl4組、CCl4+PBS組和CCl4+tTβRII組均每日9:00直接腹腔注射200 μL CCl4/橄欖油混合液，1次/d，共4 d，其中CCl4+PBS組和CCl4+tTβRII組在第3天和第4天當日15:00直接尾靜脈注射PBS和目的蛋白tTβRII(60 μg)。最后一次注射24 h后，通過腹腔注射4%水合氯醛來麻醉小鼠，將分離的肝臟部分用于4%甲醛固定和組織脫水包埋，剩余肝臟保留于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 HE染色 將石蠟切片(5 μm)經二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水，然后經蘇木素和伊紅染色，再依次經梯度酒精脫水和二甲苯透明，最后滴加適量中性樹脂封片，烘干后常溫保存，并在普通光學顯微鏡下攝取圖像。

1.2.3 實時熒光定量PCR 提取肝臟RNA，逆轉錄為cDNA，PCR檢測TNF-α和IL-1β mRNA的表達水平，引物序列如表1。PCR反應體系包括：cDNA 2 μL，正向和反向引物各0.8 μL，SYBR Green Mix熒光染料9 μL，無菌蒸餾水7.4 μL。反應程序為50 ℃升溫2 min；95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火1 min；72 ℃延伸10 s，擴增40個循環，以GAPDH為內參，測出樣品的相對表達[6]。

表1 實時熒光定量PCR擴增引物序列

1.2.4 免疫組化染色 按照常規免疫組化染色方法[7]，對各處理組中小鼠肝臟組織石蠟切片進行TNF-α和IL-1β蛋白染色，光學顯微鏡攝取圖像。

1.3 統計學分析用SPSS 17.0軟件進行數據分析。數據采用“均數±標準差”表示，多組間比較采用one way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 tTβRII對急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響HE染色法檢測各組中肝組織的病理形態學變化，結果顯示：control組中肝小葉結構完整、肝細胞形態完整，細胞核清晰可見；CCl4組中肝小葉排列紊亂，肝細胞形態不規則，并發生變性壞死；而與CCl4組相比，CCl4+tTβRII組中肝小葉結構和肝細胞形態趨于正常，見圖1。

2.2 tTβRII對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α和IL-1β mRNA表達的影響實時熒光定量PCR檢測各組炎癥細胞因子mRNAs的表達，結果顯示：與control組比較，CCl4組中促炎細胞因子TNF-α和IL-1β mRNA表達均明顯上升，差異具有統計學意義(F=202.322，P=5.5664E-8；F=72.595，P=0.000002)；與CCl4組比較，CCl4+tTβRII組中促炎細胞因子TNF-α和IL-1β mRNA表達明顯降低，差異具有統計學意義(F=202.322，P=0.000001；F=72.595，P=0.007624)，見圖2。

圖2 tTβRII對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α和IL-1β mRNA表達的影響

2.3 tTβRII對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α和IL-1β蛋白表達的影響免疫組化檢測各組炎癥細胞因子的表達，結果顯示：與control組比較，CCl4組中棕色沉淀物明顯增加，說明促炎細胞因子TNF-α和IL-1β蛋白表達明顯上升；與CCl4組比較，tTβRII處理組(CCl4+tTβRII)中棕色沉淀物減少，說明促炎細胞因子TNF-α和IL-1β蛋白表達明顯降低，見圖3。

圖3 tTβRII對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α和IL-1β蛋白表達的影響

3 討論

急性肝損傷是各種毒素和藥物引發的肝組織病理改變，其與肝組織中細胞的氧化應激、細胞凋亡和炎癥等密切相關[8-10]。若不能及時得到有效治療，將發展為肝衰竭而影響人類生存。CCl4是誘導急性肝損傷的經典毒物，可通過調控TGF-β1信號轉導而影響炎癥細胞因子的表達。因此，炎癥細胞因子的表達與急性肝損傷密切相關[11-13]。

TGF-β1信號轉導通路具體表現為：TGF-β1與細胞膜上轉化生長因子β II型受體(TβRII)結合，使其磷酸化，進而結合并磷酸化轉化生長因子β I型受體(TβRI)，進一步將胞外信號傳遞至細胞質和細胞核，最終影響下游靶基因的轉錄和翻譯而調控靶基因的生物學功能[14-16]。因此，TβRII的磷酸化與TGF-β1信號通路轉導密切相關，阻止TβRII磷酸化可有效抑制該信號通路轉導。課題組前期已篩選到截斷型TβRII(即刪除TβRII的絲氨酸/蘇氨酸激酶區域)可與野生型TβRII在體內外競爭性結合TGF-β1。綜上所述，該tTβRII在急性肝損傷的防治中具有重要的應用前景。

本研究將制備tTβRII作用于CCl4誘導的小鼠急性肝損傷動物模型，通過檢測炎癥細胞因子的變化來探討其防治急性肝損傷的可能。HE染色結果表明，CCl4破壞小鼠的肝組織形態結構，表現為肝小葉排列紊亂，以及肝細胞形態不規則，并發生變性壞死，而經tTβRII處理后，肝小葉排列趨于規則，肝細胞形態趨于完整；說明tTβRII可通過抑制急性肝損傷小鼠肝組織中促炎細胞因子的表達，降低其對肝細胞的損傷而使其結構趨于正常。另外，實時熒光定量PCR和免疫組化結果表明，CCl4上調肝組織中促炎細胞因子TNF-α和IL-1β mRNA和蛋白表達，而經tTβRII處理后，TNF-α和IL-1β mRNA和蛋白表達均降低，說明tTβRII可在轉錄和轉錄后水平上抑制促炎細胞因子的表達來緩解CCl4引起的急性肝損傷。課題組將在后續實驗中闡明其與炎癥反應信號轉導關鍵效應分子間的關系，進一步明確tTβRII對急性肝損傷的保護的分子作用機制。

綜上所述，目的蛋白tTβRII對CCl4誘導的急性肝損傷具有一定的保護作用，其作用可能是通過影響炎癥細胞因子實現的，可為急性肝損傷的防治提供理論依據。