牛羊不同布魯氏菌病血清學(xué)檢測方法的比較

莫茜，陽愛國，郝力力，李春隆，袁東波，楊天俊，李盛瓊，尹杰，高露，侯巍

（1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心 成都 610041；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)系成都 610041；3.儀隴縣畜牧站 四川南充 637000；4.富順縣水產(chǎn)漁政服務(wù)中心 四川自貢 643000）

布魯氏菌病（以下簡稱布病）是由布魯氏菌屬細(xì)菌侵入機(jī)體引起的一種人畜共患傳染病，動物感染布病主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、睪丸炎、附睪炎等[1]，造成生產(chǎn)性能和繁殖機(jī)能的下降；全球有170多個(gè)國家和地區(qū)都報(bào)告過布病病例[2]，每年報(bào)告約50萬人感染布病[3]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會公共衛(wèi)生問題。我國將其列為乙類傳染病、二類動物疫病。自21世紀(jì)以來，隨著畜牧業(yè)發(fā)展，動物流動性增加等原因，我國牛羊布病感染狀況總體呈上升趨勢，近年來，全國動物疫控系統(tǒng)通過不斷推進(jìn)布病防治、監(jiān)測和凈化，取得了一定的成效。但受動物流動性大、基層防疫體系薄弱、淘汰病畜難度大、防治經(jīng)費(fèi)投入不足等因素影響，我國布病防控形勢依然十分嚴(yán)峻。

布病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括病原學(xué)方法和血清學(xué)方法。由于病原分離耗時(shí)長，對實(shí)驗(yàn)室生物安全級別要求高、存在風(fēng)險(xiǎn)等原因，因此并不常用；血清學(xué)診斷方法操作簡單、適用性廣，包括虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、乳牛全乳環(huán)狀試驗(yàn)（MRT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、熒光偏振測試（FPA）、膠體金免疫層析法（G ICA）[4]等。SAT法優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜，可以定量測定抗體水平，具有較高的特異性，因此多用于布病檢測的復(fù)核確認(rèn)[5]。ELISA法操作方便，靈敏度高，一次可以完成大量樣品的檢測，在2018年納入我國法定布病檢測方法。c ELISA不僅可以檢測交叉感染，還可以鑒別疫苗接種和野毒株感染[6]。膠體金免疫層析技術(shù)具有快速檢測的特點(diǎn)，不需要配置儀器，但需要通過肉眼判定結(jié)果，敏感度不夠高，存在假陽性和假陰性，比較適合于流行病學(xué)調(diào)查及野外現(xiàn)場檢測[7]。

為檢測對比各種試劑的有效性，確保布病檢測結(jié)果準(zhǔn)確，減少漏診和誤診情況，本研究對3種布病血清學(xué)檢測方法進(jìn)行了比對試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測試劑布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)抗原，購自中監(jiān)所，批號20191030，布魯氏菌病競爭ELISA抗體檢測試劑盒，購自青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，批號020162004，布魯氏桿菌抗體高敏熒光檢測試劑盒，購自成都微瑞生物有限公司，批號BRB20102116379。

1.1.2 血清樣本血清樣本為筆者所在中心保存的已知感染情況的牛羊血清，其中牛血清樣本92份，羊血清樣本92份。

1.1.3 設(shè)備與耗材96孔酶標(biāo)儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；37℃恒溫箱，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；精確的單道微量移液器和多道微量移液器，Transfe rpe tte公司產(chǎn)品；一次性移液器吸頭：Axygen公司產(chǎn)品；高敏熒光分析儀，Wellra y?WR-1808。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)方法：試管凝集試驗(yàn)按照GB/T18646—2018進(jìn)行操作與判定，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、高敏熒光免疫分析試驗(yàn)按試劑操作說明書進(jìn)行操作和結(jié)果判定。

數(shù)據(jù)處理方法：對檢測數(shù)據(jù)采用Excel處理，用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用假陽性率、假陰性率、一致率和Ka p pa值四種分析指標(biāo)。

假陽性率與實(shí)驗(yàn)的特異性有關(guān)，即在金標(biāo)準(zhǔn)判斷為陰性樣本中，檢測出為陽性的幾率。假陰性率與實(shí)驗(yàn)的敏感性有關(guān)，即在金標(biāo)準(zhǔn)判斷為陽性樣本中，檢測出為陰性的幾率。一致率是檢測方法的相關(guān)程度，指確診的陽性與陰性樣本且與兩種檢測方法結(jié)果相一致的總和與所有檢測樣本的百分比；Kappa值是醫(yī)學(xué)上常用的一種用于計(jì)數(shù)資料的一致性評測，是評價(jià)一致性的測量值。一般認(rèn)為，Kappa≥0.75，說明兩種方法診斷結(jié)果一致性較好；0.4≤Kappa＜0.75，說明兩種方法診斷結(jié)果一致性一般；Kappa＜0.4，說明兩種方法診斷結(jié)果一致性較差。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛不同布魯氏菌病血清學(xué)檢測試劑結(jié)果

采用試管凝集方法、競爭ELISA方法、高敏熒光檢測方法對92份已知感染情況的牛血清（其中47份為真正感染的陽性血清，45份未感染的陰性血清）進(jìn)行檢測，比較它們的敏感性和特異性。結(jié)果見表1。

表1 3種布病血清學(xué)檢測方法牛血清檢測結(jié)果比較

結(jié)果表明競爭ELISA方法、高敏熒光檢測方法Kappa值大于75%，試管凝集方法Kappa值小于75%，說明競爭ELISA方法、高敏熒光檢測方法檢測結(jié)果一致性較好，試管凝集方法一致性一般。試管凝集法的假陰性數(shù)最高，為12個(gè)，假陰性率為25.53%，高敏熒光檢測方法假陽性數(shù)最高，為2個(gè)，假陽性率為4.44%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敏感性最高的是競爭ELISA方法，特異性最高的是試管凝集方法。

2.2 羊不同布魯氏菌病血清學(xué)檢測試劑結(jié)果

采用試管凝集方法、競爭ELISA方法、高敏熒光檢測方法對92份已知感染情況的羊血清（其中13份為真正感染的陽性血清，79份未感染的陰性血清）進(jìn)行檢測，比較它們的敏感性和特異性。結(jié)果見表2。

表2 3種布病血清學(xué)檢測方法羊血清檢測結(jié)果比較

結(jié)果表明3種檢測方法Kap pa值大于75%，說明3種檢測方法檢測結(jié)果一致性較好。試管凝集法和競爭ELISA方法的假陰性率均為7.69%，競爭ELISA方法和高敏熒光檢測方法的假陽性率為1.27%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敏感性最高的是高敏熒光檢測方法，特異性最高的是試管凝集方法。

2.3 分析與討論

動物感染布病后癥狀不明顯，通過臨床診斷來確定動物是否患有布病就顯得相對困難。血清學(xué)診斷方法由于操作簡單、適用性廣，是目前國內(nèi)最常規(guī)的使用方法。本研究通過對3種布病血清學(xué)檢測方法進(jìn)行對比分析，以便為當(dāng)前布病血清學(xué)診斷方法提供參考。

試驗(yàn)檢測結(jié)果中假陽性率越高，說明容易出現(xiàn)陰性動物誤診的情況，造成撲殺動物不必要的經(jīng)濟(jì)損失；假陰性率越高，說明容易出現(xiàn)陽性動物漏檢的情況，造成病原擴(kuò)散，不利于養(yǎng)殖場或地區(qū)布病的凈化工作。試管凝集法具有較高的特異性，成本低廉，是我國布病常用的確診方法。但其敏感性相對較低，易出現(xiàn)漏診的情況，且操作時(shí)間長，檢測結(jié)果判定以人肉眼為主，易受人主觀影響[8]。競爭ELISA法為我國現(xiàn)行國標(biāo)推薦方法，本次比對試驗(yàn)結(jié)果顯示一致性、假陽性率和假陰性率均有較優(yōu)表現(xiàn)，操作簡便，可適用于批量化大規(guī)模檢測，在布病的檢測中有良好的應(yīng)用價(jià)值。膠體金免疫層析法在通常采用肉眼判斷易造成人為誤差，本研究中的高敏熒光檢測方法采用熒光儀讀數(shù)，避免了人為因素的干擾，在比對結(jié)果中也表現(xiàn)出了較好的一致性、假陽性率和假陰性率，操作簡便，反應(yīng)時(shí)間短，儀器簡易可攜帶，適用于基層大規(guī)模檢測。█