6株雞腺病毒的分離鑒定及序列分析

謝有蓮

（山東省臨沂市沂南縣畜牧獸醫局 山東臨沂 276300）

雞的包涵體肝炎是由Ⅰ群禽腺病毒引起雞的一種急性傳染病，其特征性病變表現在雞的肝臟及骨髓，肝臟組織學切片可見肝細胞內具有包涵體，細胞脂肪病變、外觀上肝臟呈腫大、出血甚至壞死，骨髓有時候呈黃色或者灰白色，腎臟充血壞死，該病世界各個國家廣泛存在，此病既可以水平傳播又可以垂直傳播，徹底凈化很困難，在我國的發病呈逐年上升趨勢。特別是今年4月份始發于山東聊城莘縣的禽腺病毒疫情在短短幾個月的時間內傳遍了山東、河南、安徽、河北、吉林、江蘇等地，傳播速度之快，涉及范圍之廣，給我國養雞業造成了巨大的經濟損失，通過對濱州博興某雞場病死雞進行剖檢，采集病料，SPF雞胚接種分離病毒，經PCR鑒定測序分析表明，分離到的病毒主要為Ⅰ群4型禽腺病毒。

1 材料與方法

1.1 材料來源

山東濱州博興某肉雞場病死雞肝臟、腎臟、脾臟等病變組織，SPF雞胚購自濟南斯帕法斯，CEK細胞培養基購自美國Gibco公司，PMD18-T載體，PCR相關試劑，DNA Marker、DNA片段凝膠回收試劑盒購自寶生物大連有限公司，Axygen體液病毒DNA/RNA提取試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司。

1.2 病毒的分離

1.2.1 SPF雞胚接種分離及雞胚病變觀察采集疑似感染雞包涵體肝炎的肉雞肝臟、腎臟組織，用滅菌生理鹽水按照1：10比例勻漿研磨、反復凍融3次后，4,000r/min離心10min，上清液經0.22μm過濾除菌后，卵黃囊接種7日齡SPF雞胚10枚，每枚雞胚接種0.2mL，置于37℃下孵育，24h后剔除死胚，收取48h后死胚，并收取尿囊液，卵黃及胚體，18日齡后死亡的雞胚，小心解剖觀看病變。并將收獲的胚毒連續傳3代，收獲胚毒、卵黃、胚體后-80℃保存。將第三代雞胚尿囊液用無菌生理鹽水做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-107個稀釋度，每個梯度分別卵黃囊接種6枚7日齡的SPF雞胚0.2mL，置于37℃下孵育，24h后剔除死胚，記錄48h后每個梯度雞胚死亡數，按照Reed-Muench法計算半數致死量。

1.2.2 雞胚腎細胞的培養及細胞病變觀察將病雞胚肝組織懸液經反復凍融、過濾除菌后，取0.2mL接種到長勢良好的單層雞胚腎細胞上，于37℃5%CO2培養箱中吸附1h。將上層液體倒掉倒掉，換上新鮮的DMEM細胞維持液，同時設未接種病料的陰性對照，繼續培養觀察。

1.3 病毒的PCR鑒定

1.3.1 檢測引物的合成按照文獻中李海英等[1]所建立的雞包涵體肝炎PCR診斷方法合成引物如表1，引物由生工生物（上海）有限公司合成。

表1 引物序列及長度

1.3.2 病毒基因組的提取 將收獲的胚毒凍融一次后4,000r/min離心5min，上清作為待檢樣品，按Axygen體液病毒DNA/RNA提取試劑盒使用說明書快速提取病毒DNA，DNA模版存于-80℃。

1.3.3 PCR擴增禽腺病毒鑒定的反應體系為：TaqDNA聚合酶2.5U，10×PCR Buffer 2.5μL（含Mg2+），2.5mmol/L的d NTP Mixture 2μL，上下游引物各1μL，基因組DNA 1μL，加滅菌雙蒸水至25μL，擴增參數為：94℃預變性5min，94℃45s，55℃45s，72℃45s，30個循環，最后72℃延伸10min，PCR擴增產物通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察結果。

1.4 擴增產物的回收、連接及測序分析

使用DNA凝膠回收試劑盒將剩余PCR產物回收純化，將目的片段與PMD18-T載體4℃條件下連接過夜，并將連接產物轉化大腸桿菌DH5A，經氨芐抗性平板篩選，挑取單菌落加LB培養基培養16h后提取質粒進行PCR鑒定及雙酶切鑒定，將陽性質粒送生工生物工程（上海）有限公司進行測序，測后序列與NCBI上多個基因序列進行比較分析。

1.5 分離毒的凝集特性測試

按常規方法制備1%濃度的雞紅細胞，檢測分離到的雞腺病毒是否具有凝集這些紅細胞的特性，同時設Ⅲ群禽腺病毒EDSV株為凝集反應陽性對照。

1.6 分離毒的純凈性檢測

使用本實驗室已經建立的常見病毒的檢測方法，對分離毒中是否含有其常見禽病病毒進行檢測，檢測項目包括：新城疫病毒（NDV）、流感病毒（AIV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、馬立克病毒（MDV）、網狀內皮組織增殖病病毒（REV）、禽呼腸孤病毒（REO）。

2 結果

2.1 SPF雞胚接種分離、傳代及雞胚病變觀察

卵黃囊接種7日齡雞胚后，雞胚第11日齡全部死亡，傳三代后將雞胚尿囊液用無菌生理鹽水做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-107個稀釋度，每個梯度分別卵黃囊接種6枚7日齡的SPF雞胚0.2mL，置于37℃下孵育，24h后剔除死胚，記錄48h后每個梯度雞胚死亡數，按照Reed-Muench法計算半數致死量。

從接種3d后到20d零星死亡，18d后死亡的雞胚剖檢后可見明顯的心包積液，肝臟有壞死點，腎臟充血腫大，如圖1所示。

圖1 18日齡雞胚死亡病變

2.2 測序結果及序列分析

從聊城莘縣、淄博、濱州、臨沂、濰坊地區所分離的6種禽腺病毒其Hexon部分基因序列經測序后與GeneBank中禽腺病毒基因序列比對，經DNASTAR及BLAST軟件分析后結果表明莘縣、淄博、濱州、臨沂4個分離株與Genebank上Ⅰ群4型雞腺病毒序列EU177546.1、EU931691.1、KM 250090.1同源性高達98%，濰坊分離株與GeneBank中序列KC 750789.1（FAV11）同源性可達97%，根據序列比較結果繪制了遺傳系統進化樹如圖2，所有參與比較的序列中，除了6株分離株外，其他序列均來源于GeneBank。

圖2 遺傳系統進化樹

2.3 分離毒的血凝性測試及純凈性檢測

收集SPF雞胚的第四代胚毒尿囊液進行血凝試驗，分離株不能凝集1%的雞紅細胞，證明分離毒均不具有血凝性，而對照的三群雞腺病毒卻能夠凝集1%的雞紅細胞。

使用本實驗室已經建立的檢測方法，對分離病毒進行流感、新城疫、傳支等常見病毒的RT-PCR及PCR檢測，結果表明分離毒均未檢測出常見病毒。

3 結語

綜上所述，雞腺病毒是一種危害較為嚴重的病原，該種病原會造成患病及各個臟器組織出現不同程度的病變，威脅較為嚴重，引發的死亡率相對較高。通過有效的病原分離鑒定，能夠進一步掌握腺病毒的具體血清型和生化特點，為構建綜合性的防控方案奠定堅實的基礎，降低腺病毒對雞養殖產業造成的嚴重威脅。█