慢性溫和不可預知應激對大鼠行為學、促炎癥細胞因子及腦源性神經營養因子水平的影響▲

沙中瑋 肖姝雲 錢春美 李 歐 張 潔 高圓媛 徐 建

(上海中醫藥大學附屬市中醫醫院1 神志病科，2 實驗中心，上海市 200071，電子郵箱：shazhongwei1989@163.com)

壓力應激是抑郁癥、焦慮癥發生發展的影響因素[1-2]，研究人員一直致力于建立一種高效度的模擬人類情緒應激狀態的動物模型，發現長期暴露于壓力環境下的嚙齒動物會出現焦慮、抑郁樣行為；慢性溫和不可預知應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型是一種應用廣泛、有效且可靠的復合應激模型[3-4]，能夠誘導嚙齒動物產生焦慮、抑郁樣行為[5]。本研究通過CUMS誘導大鼠產生心理社會應激反應，觀察大鼠體質量、行為學、外周血清促炎癥細胞因子及腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)水平的變化，為進一步實驗研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級Wistar雄性大鼠12只，體質量均為200 g左右，購于上海斯萊克實驗動物有限公司[動物生產許可：SCXK(滬)2017-0005，動物質量合格證編號：2015000562560]，飼養于上海中醫藥大學附屬市中醫醫院動物實驗中心[實驗動物使用許可證號：SYXK(滬)2014-0019]，每籠4只，飼養環境：室溫(23±2)℃，濕度80%，12L/12D光照節律，適應性喂養7 d，其間自由飲水攝食。

1.1.2 主要試劑和儀器：大鼠曠場實驗箱(安徽正華生物儀器設備有限公司，尺寸：50 cm×50 cm×50 cm，型號：ZH-PS)；ZH-ZFT型自發活動實驗視頻分析系統(上海彤興生物科技有限公司)；大鼠高架十字迷宮視頻分析系統(成都泰盟軟件有限公司，型號：PMT-100；高架十字迷宮尺寸：各臂臂長425 mm，寬度100 mm，高架高度500 mm，開臂臂高10 mm，閉臂臂高225 mm)；超純水機(HealForce公司，型號：NWVF-10)；洗板機(Labsystems Dragon公司，型號：4MK2)；微孔板孵化器(Bio-Rad公司，型號：237)；酶標儀(Labsystems Dragon公司，型號：MK3 353)；酶標系統(上海百基生物科技有限公司，型號：Varioscan Flash)；腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-6、BDNF酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(武漢博士德公司，批號：240141101108、133141051108、3714921108)。

1.2 實驗分組及CUMS模型的建立[1]將12只大鼠按隨機數字表法隨機分為空白組和模型組，各6只。適應性喂養7 d后，測量每只大鼠體質量。空白組不給予任何處理，模型組進行為期28 d的CUMS刺激：給予禁水、禁食、潮濕墊料、籠傾斜45°、混籠、光周期變化、強迫游泳(水溫23.2℃)5 min等7種不可確定性輕度刺激，1次/d，按造模刺激時間表進行刺激，并于第28天CUMS刺激結束后，行為學實驗開始前測量每只大鼠體質量。

1.3 行為學實驗

1.3.1 曠場實驗：于造模前、造模第14天和造模第28天后分別對每只大鼠進行曠場實驗。研究者持大鼠尾根1/3處將其輕輕放入曠場實驗箱底中央(底色為黑色)，立即蓋上嵌有攝像頭的實驗箱蓋子(底色為黑色)，攝像系統及ZH-ZFT型實驗視頻分析系統自動同步記錄大鼠5 min內的行為變化，研究者根據監測結果記錄大鼠總路程、中央活動路程和平均速度，每只大鼠測試1次。每只大鼠測試完畢，研究者用20%酒精擦拭箱底，再用干紗布擦凈。

1.3.2 高架十字迷宮實驗：造模第28天曠場實驗結束后，同日進行高架十字迷宮實驗。測試前，將大鼠提前5 min單獨放置在一個白色塑料箱(60 cm×60 cm×35 cm)中適應新環境5 min，隨后將大鼠輕輕放置于高架十字迷宮的中央，使其頭部朝向開臂區，釋放大鼠后通過攝像系統及PMT-100十字迷宮視頻分析軟件同步記錄大鼠5 min內的開放臂區進入次數、開臂區滯留時間、閉臂區進入次數、閉臂區滯留時間、中央區進入次數、中央區滯留時間等相關參數，總時間=開臂區滯留時間+閉臂區滯留時間+中央區滯留時間，總次數=開臂區進入次數+閉臂區進入次數。計算焦慮指數[6-7]。焦慮指數值在0～1范圍內，焦慮指數越高表示類似焦慮的行為越頻繁。

1.4 ELISA法檢測大鼠外周血清TNF-α、IL-6及BDNF水平 在造模第28天行為學實驗結束后，立即將大鼠麻醉后抽取腹主動脈血3～5 mL，室溫凝固2 h或4℃過夜，3 000 r/min離心10 min，收集血清置于-80℃冷藏待測。采用ELISA試劑盒分別檢測血清TNF-α、IL-6、BDNF水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，不符合正態分布的計量資料以[M(P25，P75)]表示，比較采用秩和檢驗。重復測量計量資料的比較采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組大鼠造模前后體質量的比較 造模前兩組大鼠體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。造模第28天后，模型組大鼠體質量輕于空白組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠造模前后體質量的比較(x±s，g)

2.2 兩組大鼠曠場實驗結果的比較 經球形檢驗，兩組曠場實驗總路程數據符合球形假設(P=0.083)。主體間效應方差分析檢驗顯示，兩組大鼠總路程比較，差異無統計學意義(F組間=0.928，P組間=0.358)，兩組總路程均有隨時間的延長而下降的趨勢(F時間=35.237，P時間<0.001)，分組與時間不存在交互效應(F交互=2.098，P交互=0.149)。見表2。

經球形檢驗，兩組曠場實驗中央活動路程數據符合球形性假設(P=0.295)。主體內效應檢驗顯示，兩組大鼠中央活動路程比較，差異無統計學意義(F組間=1.913，P組間=0.197)，兩組中央路程均有隨時間變化的趨勢(F時間=4.014，P時間=0.034)，其中，兩組中央活動路程從造模開始至造模第14天呈現上升的趨勢，造模第14天開始至造模第28天呈現明顯下降趨勢。分組與時間不存在交互作用(F交互=1.359，P交互=0.280)。但造模第28天，模型組中央活動路程短于空白組(P<0.05)。見表2。

經球形檢驗，兩組曠場實驗平均速度數據滿足球形性假設(P=0.083)。主體間效應檢驗顯示，兩組大鼠平均速度比較，差異無統計學意義(F組間=0.933，P組間=0.357)，兩組平均速度均有隨著時間的延長而下降的趨勢(F時間=35.232，P時間<0.001)，分組與時間不存在交互效應(F交互=2.099，P交互=0.149)。見表2。

表2 兩組大鼠曠場實驗總路程結果比較(x±s)

2.3 兩組大鼠高架十字迷宮實驗結果的比較 模型組大鼠的開臂區滯留時間短于空白組(P<0.05)，而兩組大鼠開臂區運動距離、開臂區進入次數、開臂/在臂進入次數百分比、開臂/在臂滯留時間百分比比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。兩組大鼠的閉臂區滯留時間、閉臂區運動距離、閉臂區進入次數、閉臂/在臂進入次數百分比、閉臂/在臂滯留時間百分比比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。兩組大鼠的中央區滯留時間、中央區運動距離、中央區進入次數比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。造模第28天，模型組、空白組的焦慮指數分別為(0.87±0.05)%、(0.78±0.07)%，模型組焦慮指數高于空白組(t=-2.563，P=0.028)。

表3 兩組大鼠高架十字迷宮開臂區行為學的比較

表4 兩組大鼠高架十字迷宮閉臂區行為學的比較

表5 兩組大鼠高架十字迷宮中央區行為學的比較(x±s)

2.4 兩組大鼠外周血清TNF-α、IL-6、BDNF水平的比較 兩組大鼠血清TNF-α水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。模型組大鼠血清IL-6水平高于空白組，但BDNF水平低于空白組(P<0.05)。見表6。

表6 兩組大鼠外周血清TNF-α、IL-6及BDNF水平的比較(x±s，pg/mL)

3 討 論

隨著我國經濟社會的快速轉型、生活節奏的加快，每個人都頂著多重身份和角色，壓力或應激充斥著每個人的生活和工作，心理健康問題日益凸顯，其已成為備受關注的精神心理公共衛生問題。長期暴露在情緒應激的壓力環境下，人們的行為會產生病理性改變。本研究通過構建CUMS大鼠模型模擬人類的情緒應激反應，觀察CUMS對大鼠行為學、外周血清促炎癥因子及BDNF水平的影響。

曠場實驗通常被用于測定嚙齒動物的運動功能和情緒[8]，具有操作簡單、可行性良好等特點，能夠通過記錄總活動路程、中央活動路程等指標評價大鼠的不同行為變化。曠場實驗中央區活動反映了嚙齒動物對新奇環境的探索行為[9]。但研究顯示，疲勞或抑郁的大鼠自主運動能力下降，更喜歡在箱子的邊緣區域活動，且其總活動路程會減少[10]。本研究結果顯示，造模第28天，模型組中央活動路程短于空白組(P<0.05)，而造模前、造模第14天、造模第28天兩組大鼠的總路程和平均速度比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示造模第28天大鼠在曠場實驗中存在一定的探索矛盾心理，造模前和造模14 d時焦慮水平不明顯。

高架十字迷宮通過記錄嚙齒動物在開臂區和閉臂區的滯留時間、進入次數來評價焦慮樣行為，被廣泛應用于嚙齒動物焦慮行為的評估，并常用于抗焦慮藥物的篩選[11]。開臂區相關行為學指標反映焦慮行為的變化，本研究結果顯示，模型組大鼠的開臂區滯留時間短于空白組(P<0.05)，而兩組大鼠開臂區運動距離、開臂區進入次數、開臂/在臂進入次數百分比、開臂/在臂滯留時間百分比比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示CUMS大鼠趨于避開開臂區，表現出一定的焦慮樣行為。閉臂區相關行為學指標主要反映自主活動變化中央區域是開臂與閉臂的交叉區域，主要用于測試開始時動物選擇活動區域以及計算總時間，本研究結果顯示，造模第28天兩組大鼠的閉臂區滯留時間、閉臂區運動距離、閉臂區進入次數、閉臂/在臂進入次數百分比和閉臂/在臂滯留時間百分比以及中央區滯留時間、中央區進入次數、中央區運動距離比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，與空白組比較，造模第28天模型組大鼠的體質量降低，焦慮指數升高(P<0.05)，提示持續28 d的CUMS能夠使大鼠體質量下降，誘導大鼠產生焦慮樣行為。

研究證明，慢性應激能夠下調BDNF的表達[12]，促進炎癥反應[13]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清IL-6水平高于空白組，BDNF水平低于空白組(均P<0.05)，但兩組大鼠的TNF-α水平差異無統計學意義(P>0.05)，提示CUMS可以誘導大鼠外周血清BDNF水平降低，促進促炎癥細胞因子IL-6的釋放。這與既往研究結果相似[14-16]。說明CUMS誘導焦慮樣行為的發生機制可能與促炎癥因子的釋放、BDNF的減少有關。

綜上所述，CUMS能夠誘導大鼠產生焦慮樣行為，使大鼠體質量下降，促進IL-6釋放，降低血清中BDNF水平。雖然焦慮的確切機制尚不清楚，但可能與促炎癥細胞因子介導的炎癥反應、BDNF的減少導致疾病條件下神經元受損有關[17]。