FIV靜置對FIV沉淀分離及人血白蛋白質量影響的研究

李 劍 金 川 李 銳 楊建東 于 李

（成都蓉生藥業有限責任公司，四川 成都 610000）

人血白蛋白因具有維持血管內膠體滲透壓，結合并轉運體內各種脂肪酸、激素、離子以及多種藥物的重要生物學功能，被廣泛應用于各種低白蛋白癥或創傷性休克[1]及肝硬化或腎病引起的水腫或腹水等疾病。近年來，隨著人血白蛋白臨床需求的不斷增加，人血白蛋白的進口量不斷增大[2]，2020年進口白蛋白已占國內批簽發總量63.96%，而隨著監管日趨嚴格和血漿資源緊缺，國內血液制品廠家將面臨更大挑戰，所以不斷優化生產工藝，提高血漿綜合利用率和產品質量是當前各大本土廠家面臨的迫切課題。目前市場上大多數血液制品企業采用的是改良后的低溫乙醇工藝 Cohn6/9 法或 N-K（Nitschmann-Kistler）法[3]，該法在低溫乙醇條件下通過在各個分離階段改變（pH、溫度、蛋白濃度、離子強度、乙醇濃度）五變參數等措施，經多步沉淀和壓濾分離，使中間制品固液相分離，使目標蛋白不斷純化。在FIV分離階段各個廠家根據自身工藝條件、分離步驟及工藝參數都有所不同，針對FIV制作反應結束后有無靜置及靜置時間也并不一致，長時間靜置對產品質量及安全性方面影響文獻報道較少。該實驗采用低溫乙醇工藝制備人血白蛋白時，在FIV階段制作完成后通過有無靜置的不同工藝，來比較2種不同工藝對產品質量的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備

主要材料與設備包括95%醫用乙醇 、助濾劑、注射用水、健康人血漿、緩沖液、壓濾機（EUROFILTEC FC.800. AC）、全自動電泳儀（MICROTECH648ISO）、高效液相色譜儀（Agilent1200）、動態試管儀。

1.2 方法

實驗采用低溫乙醇工藝制備人血白蛋白時，在工藝穩定的情況下，確保各項工藝參數的一致性，在FIV制作反應結束后，對2組各16個投漿批次分別采取無靜置直接壓濾分離和靜置（48h）后壓濾分離的不同參數控制工藝，將其合并為相對應的8個FV沉淀精制，對批次后續制劑階段產品的多聚體含量、純度等關鍵質量指標及其原液內毒素含量進行分析。工藝流程如圖1所示。

圖1 工藝流程圖

1.2.1 過濾壓力

取FIV 過濾整個過程最大壓力作為過濾壓力，記錄2種不同參數控制工藝所達到的壓力 （MPa）。

1.2.2 多聚體含量

使用 HPLC檢測人血白蛋白成品的多聚體含量，對比2種不同的FIV參數工藝下所得的產品中多聚體含量的情況。

1.2.3 純度

使用醋酸纖維素薄膜電泳法檢測人血白蛋白成品純度，對比2種不同的FIV參數工藝下所得的產品純度情況。

1.2.4 原液內毒素含量

使用動態濁度法測定人血白蛋白原液的內毒素含量，對比2種不同的FIV參數工藝下所得的原液內毒素含量情況。

1.3 統計學分析

采用Microsoft Office Excel 2013進行數據處理，計量數據以“均數±標準差（x±s） ”表示，采用獨立樣本 T 檢驗用于數據的比較，以P<0. 05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 過濾壓力

實驗結果顯示，FIV階段靜置（48h）后過濾16批人血白蛋白制品過濾壓力為（0.22±0.01）MPa，而無靜置直接過濾16批人血白蛋白制品過濾壓力為（0.29±0.01）MPa，差異有統計學意義（t=-16.56，P=1.2258E-16，P<0.000），表明采用靜置后過濾在過濾過程中能明顯降低過濾壓力，見圖2。

圖2 FIV反應結束16批次有無靜置過濾壓力變化

2.2 主要質量指標比較

實驗結果顯示，FIV階段靜置（48h）后過濾8批人血白蛋白產品純度為（98.29±0.11）%，多聚體為（2.80±0.18）%，而無靜置直接過濾8批人血白蛋白產品純度為（98.20±0.11）%，多聚體為（2.80±0.17）%，2組數據比較差異均無統計學意義（t分別為1.594和0.000），P分別為0.133和1.000），表明2種不同的FIV參數工藝在多聚體及純度指標上并未表現出明顯變化。見圖3、圖4和表1。

圖3 FIV反應結束有無靜置改變人血白蛋白成品多聚體變化

圖4 FIV反應結束有無靜置改變人血白蛋白成品純度變化

表1 FIV反應結束有無靜置過濾主要質量指標的比較

2.3 原液內毒素指標

由于中國藥典2020版人血白蛋白原液檢定無內毒素限值要求，參考半成品熱原檢查細菌內毒素限值蛋白濃度20%應小于1.67EU/ml[4]，將16批FV沉淀合并為相對應的8批次FV沉淀精制（每2投漿批次合并為1批FV沉淀精制），經超濾后制成原液分別檢測原液內毒素含量，實驗結果顯示，原液內毒素含量均處于極低水平。見表2。

表2 FIV反應結束有無靜置原液內毒素變化

3 討論

低溫乙醇工藝生產人血白蛋白時當血漿蛋白經FI+II+III壓濾分離獲得上清液后，進入FIV分離階段，FIV分離純化效果對最終產品的收率和質量影響尤為關鍵。FIV分離純化主要通過制作和壓濾2個生產環節實現，在制作過程結束后通常采用老化和適當靜置的方法，延長制品反應時間，促使溶液中等電點蛋白更完全充分沉淀，以期望達到更好的分離效果。在進入過濾階段通過壓濾分離能夠有效去除熱原和各種雜質（α-球蛋白、β-球蛋白、凝血酶原、PKA、變性蛋白等），實現廢棄沉淀和上清液分離，所以為了達到更佳的固液相分離效果，如何合理選用濾板和助濾劑種類（硅藻土、珍珠巖）及用量，過濾過程溫度保證、過濾壓力、濾液澄清度、流速控制等，將直接影響過濾過程中過濾效果，從而影響壓濾分離質量。

有研究表明，為了避免蛋白溶液在離心和泵送過程中，由于高剪切力對沉淀顆粒造成的破壞，在反應條件終止后和離心或壓濾操作前，此時沉淀物已經生成，在這種情況下已經可以進行下一步工藝如壓濾或離心等固液分離步驟，但也可使沉淀物與母液在一定條件下繼續靜置一段時間，進行“批次老化”，以進一步促進沉淀形成，使沉淀物的性質隨時間發生不可逆的結構變化，能夠改善分離質量[5]。本次實驗結果與上述報告相符，本次實驗結果更進一步表明在FIV階段采取靜置（48h）后壓濾分離，與無靜置直接壓濾相比，過濾壓力降低24.14%，分析原因可能是由于在老化和靜置期間，在沉淀的形成過程中沉淀蛋白顆粒強度增加、直徑增大[5]， 晶型完善與晶形轉變等密切相關，制品在低頻條件和靜態混合過程中，沉淀蛋白的聚合發生結構上變化，空間構型更加穩固，對剪切力有較強抵抗力，增強了蛋白質穩定性，沉淀蛋白質顆粒直徑增大，強度增加也有助于在壓濾過程中與助濾劑一起形成更加疏松的濾餅，有利于提高濾過液的流速，從而降低了過濾壓力。而楊宇等的研究表明，各種濾材均有其過濾面積和最大過濾壓力承受負荷，過濾壓力降低一方面能夠降低過濾過程中因過濾壓力過高帶來的安全隱患；另一方面，如果過濾壓力過高超過濾材最大承受壓力負荷，將會導致過濾效果下降，影響產品質量[6]。而FIV階段在隨著制品不斷過濾，在過濾中后期濾餅厚度增加，過濾壓力出現明顯升高，過濾阻力增大，導致過濾流速緩慢，出現過濾時間延長現象，而廢棄沉淀收集時濾餅中液體含量往往較多，所以過濾壓力改變，將直接影響過濾性能。

FIV階段有無靜置成品多聚體及純度指標并未表現出明顯變化，可見低溫乙醇工藝由不同的生產工藝模塊構成，作為在每個生產環節處于連續流動式運行的復雜生產系統，要在每個生產工藝步驟獲得最佳的分離純化效果， 須充分考慮五變參數調整，對降溫幅度、攪拌速度及緩沖液添加速度等關鍵影響因素進行細致研究，單一改變某一非關鍵工藝過程并不會對最終產品質量造成明顯影響。兩者原液內毒素含量方面相比，均處于極低的水平，經分析長時間靜置的制品在低溫乙醇條件下儲存于密閉容器中，有效避免與生產環境空氣中微粒、微生物接觸，而且制品處于低溫乙醇狀態下也不利于微生物滋生。所以為了確保長時間靜置過程中制品微生物安全，生產操作過程中人員操作、潔凈室環境、設備清潔效果、物料的投放方式等需要保證規范，并且對其進行持續監控，避免人員操作過程中無意識情況下將潔凈室微粒、微生物等異物混入制品中，反應液在整個生產周期應盡量在密閉容器環境下生產，保證工藝流程穩定和可控，才能保證人血白蛋白生產工藝生產出安全的產品。

4 結論

該實驗結果表明，在FIV分離階段采取靜置（48h）后壓濾分離，能夠明顯降低過濾壓力以及單位面積內濾板壓力負荷，防止過濾壓力過高造成濾板構造改變乃至破損，從而導致過濾性能下降或失效風險（濾液濁度偏高、濾液渾濁），靜置（48h）后壓濾分離有利于沉淀物的收集，確保固液分離的質量。而在產品質量方面，2種不同的FIV參數工藝在多聚體及純度指標上并未表現出明顯變化，其最終產品質量均符合《中國藥典》要求，在原液內毒素含量方面均處于檢測下限，表明FIV階段長時間靜置能夠確保微生物安全，所以在FIV分離階段適當設定靜置時間，能夠有效改善制品的分離質量，保障產品安全性。