酶輔助高效提取龍蝦殼中甲殼蛋白的工藝研究

賈存江，王英燕

(1 江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，江蘇 淮安 223003；2 江蘇神華藥業(yè)有限公司，江蘇 淮安 211600)

龍蝦學(xué)名Palinuridae，屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)軟甲綱十足目龍蝦科[1]。龍蝦原產(chǎn)于中、南美洲地區(qū)，20世紀(jì)從日本引入，目前，江蘇、浙江、安徽、南海等是我國(guó)龍蝦主要分布地區(qū)[2]。龍蝦具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，在河湖、池塘、水田等各類(lèi)水體環(huán)境中均能生存。作為一種高營(yíng)養(yǎng)、味道鮮美的食品，龍蝦在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)獨(dú)占一隅，據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅江蘇南京地區(qū)，每年旺季的龍蝦日消費(fèi)量高達(dá)90噸，由此也產(chǎn)生了大量的龍蝦加工廢棄物。龍蝦加工廢棄物中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，如蝦青素、甲殼素、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)鹽類(lèi)(鈣、鎂、磷等)，還含有卵磷脂、腦磷脂、類(lèi)胡蘿卜素等營(yíng)養(yǎng)成分。

在龍蝦加工過(guò)程中所產(chǎn)生的龍蝦廢棄物，如果能得到進(jìn)一步的利用，必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。通過(guò)對(duì)龍蝦加工廢棄物(主要是蝦頭和蝦殼)中的蝦青素、龍蝦油、甲殼蛋白等的提取可以實(shí)現(xiàn)對(duì)龍蝦加工廢棄物的重復(fù)利用。龍蝦廢棄物中含有多種天然蛋白，張愛(ài)軍等[3]通過(guò)堿法對(duì)龍蝦廢棄物中的甲殼蛋白進(jìn)行提取，制備甲殼素。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于龍蝦加工廢棄物中蛋白質(zhì)提取方法的研究報(bào)道較少。

龍蝦廢棄物中蛋白質(zhì)的提取方法包括堿提取法[4-5]、酸提取法、水洗提取法、鹽提取法、有機(jī)溶劑提取法[6-7]、超聲波輔助提取法[8-10]和酶解法[11]等，其中超聲波輔助提取法和酶解法作為新型的蛋白質(zhì)提取方法，展現(xiàn)出了高提取率、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[12]。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

龍蝦殼，購(gòu)于淮安市當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，牛白蛋白、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，考馬斯亮藍(lán)G250、生化試劑；高錳酸鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、無(wú)水乙醇、磷酸等均為分析純；去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 方 法

1.2.1 龍蝦殼預(yù)處理

取新鮮龍蝦若干，將其殺死，除去龍蝦蝦肉，收集剩余蝦殼和蝦頭，用水沖洗干凈，浸泡到95%乙醇中除去蝦殼中的黃色素，24 h后過(guò)濾洗凈，浸泡到5%的鹽酸溶液中使龍蝦殼完全軟化，脫去蝦殼中含有的碳酸鈣，4 h后過(guò)濾并用蒸餾水沖洗3～5遍，烘干待用。

1.2.2 酶輔助提取工藝考察

1.2.2.1 酶輔助提取工藝的單因素

(1)酶的種類(lèi)對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響

稱(chēng)取2份經(jīng)過(guò)預(yù)處理過(guò)的龍蝦殼，每份3.0 g，分別加入0.045 g中性蛋白酶和0.045 g木瓜蛋白酶，加入一定體積的水后，分別置于50 ℃水中酶解，分別在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h時(shí)取樣，將樣品放置于沸水中20 min滅酶，測(cè)量酶解液蛋白質(zhì)含量。

(2)酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響

稱(chēng)取5份預(yù)處理過(guò)的的龍蝦殼，每份3.0 g，加入0.045 g中性蛋白酶，加入一定體積的水后，分別置于50 ℃水中恒溫酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 后放置沸水中20 min，滅酶。測(cè)量酶解液蛋白質(zhì)含量。

(3)酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響

稱(chēng)取4份經(jīng)過(guò)預(yù)處理過(guò)的的龍蝦殼，每份3.0 g，加入0.045 g中性蛋白酶，加入一定體積的水后，分別置于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃ 水中恒溫酶解3 h,后取出放置沸水中20 min，滅酶。測(cè)量酶解液蛋白質(zhì)含量。

(4)加酶量對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響

稱(chēng)取4份經(jīng)過(guò)預(yù)處理過(guò)的龍蝦殼，每份3.0 g，分別加入不同量的中性蛋白酶，加酶量取1%、1.5%、2%、2.5%，加入一定體積的水后，分別置于50 ℃水中恒溫酶解3 h,后取出放置沸水20 min，滅酶，測(cè)量酶解液蛋白質(zhì)含量

(5)pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響

稱(chēng)取4份經(jīng)過(guò)預(yù)處理過(guò)的的龍蝦殼，每份3.0 g，加入一定體積的水后調(diào)節(jié)pH值分別為6.5、7、7.5、8分別加0.045 g的中性蛋白酶，置于50 ℃水中恒溫放置3 h,后取出放置沸水20 min，滅酶，測(cè)量酶解液蛋白質(zhì)含量。

1.2.2.2 酶解提取工藝的優(yōu)化

稱(chēng)取9份經(jīng)過(guò)預(yù)處理過(guò)的的龍蝦殼，每份3.0 g，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行提取。所以，根據(jù)正交試驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)條件列表如表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表L9(33)Table 1 Orthogonal test factor level L9(33)

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶的種類(lèi)對(duì)酶解效果的影響

由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)提取率逐漸增大，在2.5 h時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到37.2%并趨于平穩(wěn)。分析比較其酶解能力，可知中性蛋白酶酶解能力明顯優(yōu)于木瓜蛋白酶，中性蛋白酶在各個(gè)提取時(shí)間段的蛋白質(zhì)提取率都高于木瓜蛋白酶。因此，中性蛋白酶可以作為酶解法提取蛋白質(zhì)的優(yōu)選提取劑。

圖1 蛋白酶的種類(lèi)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 The effect of the species of protease on the extraction yield of protein

2.2 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖2可知：隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的提取率逐漸增大，在3 h時(shí)蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值并趨于平緩。這可能是由于隨著酶解時(shí)間的增加，大量的氨基酸暴露，對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用，阻止酶的繼續(xù)水解;另一方面，長(zhǎng)時(shí)間的攪拌，使得中性蛋白酶與空氣頻繁接觸，酶活性有所降低，綜合考慮，選擇3 h為最佳酶解時(shí)間。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on protein extraction yield

2.3 加酶量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

加酶量對(duì)酶解效果的影響，由圖3可以看出：隨著加酶量的增加，蛋白質(zhì)提取率逐漸增大，加酶量為1.5%時(shí)蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)添加酶后蛋白質(zhì)提取率降低。原因可能是加酶量低于1.5%時(shí)，隨加酶量的增加，酶與底物的接觸充分，接觸面積增加，蛋白質(zhì)提取率提高；同時(shí)由于酶本身也是蛋白質(zhì)，是被作用物的類(lèi)似物，加酶量高于1.5%時(shí)，添加過(guò)多蛋白酶會(huì)抑制蛋白酶的酶解能力，最適加酶量為1.5%左右。

圖3 加酶量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 The effect of the amount of enzyme added on the extraction yield of protein

2.4 酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖4可知：隨著提取溫度的增加，蛋白質(zhì)提取率逐漸增加，50 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大值，然后隨著溫度的增高呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。溫度也是蛋白酶制劑的重要活性制約條件。溫度偏高會(huì)使酶變性，喪失酶活，而溫度偏低會(huì)抑制酶的活性；溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致酶制劑失活，導(dǎo)致提取率下降，最適的提取溫度為50 ℃左右。

圖4 溫度對(duì)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 The effect of temperature on the extraction yield of protein

2.5 pH值對(duì)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖5可知：隨pH值的增加，蛋白質(zhì)提取率提取率逐漸增加，當(dāng)PH為7.0時(shí)提取率達(dá)到最大值，然后隨著PH的增加蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。蛋白酶是有活性的生物制劑，pH值是制約其催化活性的重要因素之一，pH值偏低或者偏高對(duì)蛋白酶的催化作用具有促進(jìn)或抑制作用；并且pH過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)引起中性蛋白酶的變性或者失活，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率下降，中性蛋白酶的最適pH為7.0。

圖5 pH值對(duì)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 The effect of pH value on the extraction yield of protein

2.6 酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶解溫度、加酶量和pH值3個(gè)主要影響因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選用L9(33)為正交試驗(yàn)表，正交設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

圖6 正交設(shè)計(jì)趨勢(shì)圖Fig.6 Orthogonal design trend diagram

2.7 方差分析

表3 方差分析Table 3 variance analysis

正交試驗(yàn)結(jié)果如上圖所示，極差分析結(jié)果顯示3個(gè)因素對(duì)酶解效果影響的主次順序?yàn)镃(pH值)>B(加酶量)>A(酶解溫度)；由極差分析可知最優(yōu)方案為A2B2C2。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)表明A2B2C2組的提取率為43.58%，優(yōu)于A2B2C3組的42.04%。因此確定A2B2C2為酶解最優(yōu)方案，即酶解溫度為50 ℃、加酶量為1.5%、pH值為7.0，此外單因素確定的最佳酶解時(shí)間為3 h。

3 結(jié) 論

本課題以龍蝦甲殼蛋白的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶輔助提取龍蝦中甲殼蛋白。研究表明：中性蛋白酶的提取效率高于木瓜蛋白酶，優(yōu)選中性蛋白酶。最佳酶輔助提取工藝為：酶解溫度50 ℃、加酶量為1.5%、pH值7.0，最佳酶解時(shí)間3 h。應(yīng)用中性蛋白酶輔助提取龍蝦中甲殼蛋白不僅可以有效提高甲殼蛋白的提取率，最佳提取收率為43.58%，還可避免提取過(guò)程中大量酸堿的使用，可有效降低環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)甲殼蛋白的綠色高效生產(chǎn)。