基于GEO數據庫及網絡藥理學研究絞股藍治療冠心病的作用機制

劉本濤， 袁彩英， 陳 睿,2， 梁水月， 黃嘉詠， 嚴振碩， 梁 燕， 霍麗妮*

(1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院，廣西 南寧 530222；3.廣西醫科大學，廣西 南寧 530021)

冠心病即冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(Coronary atherosclerotic heart disease，CHD)，是由冠狀動脈發生粥樣硬化導致血管腔狹窄或閉塞引起的心肌缺血缺氧或壞死性心臟病[1]。據《中國心血管病報告2018》[2]顯示，中國心血管病患病率處于持續增長階段，推算現患病人數2.9億，其中CHD患病人數達1 100萬，并且CHD死亡率呈不斷上升趨勢。目前CHD的治療主要以西藥為主，但都存在不同程度的毒副作用，較西藥而言中醫藥治療CHD具有一定優勢，尤其是中藥復方與西藥的聯合應用，臨床療效顯著[3-4]。

近年來，中藥絞股藍及其復方在輔助治療CHD方面取得了顯著成效[5-7]。絞股藍GynostemmaPentaphyllum(Thunb.)Makino又名七葉膽，為葫蘆科絞股藍屬多年生草質藤本攀緣植物。現代研究表明，絞股藍中主要化學成分為皂苷、多糖、黃酮類等，具有降血糖、降血脂、保肝、抗動脈粥樣硬化、保護心腦血管等作用[8-10]。絞股藍治療CHD雖然具有顯著療效，但其作用的分子機制尚不明確，還有待深入研究。因此，本研究利用基因表達綜合數據庫(Gene expression omnibus，GEO)對CHD相關差異表達基因進行分析并將其作為疾病靶標，同時借助網絡藥理學方法探索絞股藍治療CHD的作用靶點及相關通路，以闡明絞股藍治療CHD的分子機制。

1 材料與方法

1.1 數據庫和數據處理工具 GEO數據庫(https：//www.Ncbi.nlm.nih.gov/geo/)、TCMSP數據庫(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、PubChem數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss Target Prediction數據庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)、STRING數據庫(https：//string-db.org/)、DAVID6.8數據庫(http：//David.Ncifcrf.gov/)、KEGG數據庫(http：//www.kegg.jp)、PDB數據庫(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)、Venny2.1.0在線平臺(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)；Cytoscape3.7.1軟件、ChemDraw Professional 16.0軟件、SYBYL 2.0分子對接軟件。

1.2 基因芯片及差異表達基因篩選 在GEO數據庫中以“coronary atherosclerotic heart disease”為關鍵詞檢索與CHD相關的基因表達譜數據，并將“Organism”設置為“Homosapiens”來查找符合條件的基因芯片數據集；采用GEO數據庫提供的Analyze with GEO2R功能分析所選基因表達譜數據，以P<0.05且|logFC|≥1.5為條件篩選差異表達基因(Differentially expressed genes，DEGs)，獲取與CHD相關的靶基因。

1.3 絞股藍活性成分收集及潛在靶點預測 從TCMSP數據庫中獲取絞股藍已知化學成分，并篩選出口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18的化合物作為候選活性成分[11]；在PubChem數據庫中檢索各候選成分或利用ChemDraw Professional 16.0軟件繪制其結構式，獲取各化合物的SMILE化學式并上傳至Swiss Target Prediction數據庫，從而預測各成分潛在作用靶標；利用在線平臺Venny2.1.0將上述獲得的疾病靶基因與絞股藍候選活性成分潛在作用靶標進行匹配，得到絞股藍治療CHD的作用靶點及對應活性成分。

1.4 活性成分-作用靶點網絡構建及分析 將絞股藍治療CHD的活性成分及其作用靶點篩選結果導入Cytoscape3.7.1軟件，構建絞股藍治療CHD活性成分-靶點網絡，網絡中節點(node)代表成分及作用靶點，邊(edge)代表成分與靶點相互作用關系。利用軟件Network Analyzer功能對網絡進行分析，根據度值(degree)設置節點大小及顏色，以介數中心性(betweenness centrality)反映邊的粗細。

1.5 蛋白互作分析 采用STRING數據庫對絞股藍治療CHD的作用靶標之間的相互作用進行分析，獲取蛋白相互作用(Protein-protein interaction，PPI)網絡。保存蛋白相互作用結果文件，從中獲取node1、node2 和combined score相關信息，利用Cytoscape3.7.1構建PPI網絡，計算網絡中每個靶點的degree值，利用degree值排名靠前的靶點建立核心靶蛋白互作網絡，以degree值大小設置節點大小及顏色，邊的粗細與combine score相關聯。

1.6 GO基因功能注釋和KEGG通路富集分析 將篩選所得絞股藍治療CHD潛在作用靶點導入DAVID數據庫中進行基因本體(Gene ontology，GO)功能注釋和京都基因與基因百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，設定閾值P<0.05，靶基因名稱列表為人，根據涉及靶點數目的多少篩選排名靠前的生物過程及通路。

1.7 靶點通路分析 將絞股藍治療CHD的靶標蛋白導入KEGG數據庫，通過KEGG Mapper工具的Search Pathway功能獲取相關通路網絡，限定物種為人，篩選排名靠前的幾條通路進行整合，繪制絞股藍治療CHD的最終通路圖。

1.8 分子對接驗證活性成分-關鍵靶點 根據上述分析結果，選擇絞股藍主要活性成分及其核心靶點作為分子對接的配體和受體，經PDB數據庫篩選并下載受體蛋白及其共結晶，利用對接軟件SYBYL對受體蛋白和配體小分子進行優化，刪除水分子，添加極性氫原子，構建活性口袋并進行分子對接，預測兩者的結合性能，從而驗證本研究結果的準確性。

2 結果

2.1 CHD差異表達基因 從GEO數據庫中篩選獲取到基因芯片GSE19339，此數據集為GPL570芯片平臺采集CHD患者血栓源性白細胞的基因表達譜數據。包括4個正常樣本GSM480386～GSM480389和4個病患樣本GSM480382～GSM480385。該芯片共檢測54 675個基因，較完整覆蓋人類基因組。利用GEO2R對全部樣本進行分析，以P<0.05、|logFC|≥1.5為篩選條件，共得到1 577個DEGs，其中上調基因834個，下調基因743個，篩選所得DEGs即為CHD相關靶基因，見圖1、表1。

表1 排名前30的上調和下調表達基因

圖1 排名前30的上調和下調表達基因熱圖

2.2 絞股藍治療CHD活性成分及作用靶標 從TCMSP數據庫中收集到24個OB≥30%、DL≥0.18的候選活性成分，經Swiss Target Prediction數據庫預測，共獲取潛在作用靶點1 120個，刪除重復項后得到活性成分對應的328個潛在靶，將其與1 577個疾病靶基因進行比對取交集，得到43個共同靶標(圖2)，并且24個候選活性成分均包含在內，即為絞股藍治療CHD的作用靶點及對應活性成分，見表2，可知主要包括黃酮、植物甾醇、皂苷，可能是絞股藍發揮藥效作用的物質基礎。

表2 絞股藍治療CHD活性成分及對應靶標

圖2 CHD-絞股藍活性成分潛在靶標韋恩圖

2.3 絞股藍治療CHD活性成分-作用靶點網絡構建 利用Cytoscape3.7.1軟件構建絞股藍治療CHD活性成分-作用靶點網絡(圖3)，包括67個節點(24個活性成分、43個作用靶點)和168條邊，其中圓形節點代表活性成分，V字形節點代表靶點，邊代表成分與靶點相互作用關系。節點的degree值代表網絡中節點與節點相連的數目，其值越高，節點越大，顏色越深。由此可知，MOL009969、MOL009986、MOL009973、MOL009888、MOL000098、MOL004355、MOL000351、MOL000338、MOL000359、MOL005440、MOL000953等活性成分的degree值較大，可能是絞股藍發揮藥效的主要成分；雌激素受體β(Estrogen receptor β，ESR2)、維生素D受體(Vitamin D receptor，VDR)、維甲酸相關孤核受體α(Nuclear receptor ROR-α，RORA)、前列腺素E合成酶(Prostaglandin E synthase，PTGES)、酪氨酸激酶受體(Vascular endothelial growth factor receptor 2，KDR)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARG)、細胞周期蛋白B(Dual specificity phosphatase Cdc25B，CDC25B)、血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、受體型酪氨酸蛋白磷酸酶F(Receptor-type tyrosine-protein phosphatase F，PTPRF)、乙酰肝素酶(Heparanase，HPSE)、酰基輔酶A去飽和酶(Acyl-CoA desaturase，SCD)、脂肪酸結合蛋白(Fatty acid binding protein，FABP)等靶點分別與多個活性成分關聯，可能是絞股藍活性成分治療CHD的核心靶點。網絡中同一活性成分可作用于不同靶點，同一靶點可與多個成分對應，提示絞股藍治療CHD具有多成分、多靶點協同作用的特點。

圖3 絞股藍治療CHD活性成分-靶點網絡

2.4 PPI網絡及核心靶點 將43個潛在靶標導入STRING數據庫，置信度設為>0.4，得到PPI網絡(圖4)。利用Cytoscape3.7.1軟件計算網絡中每個靶點的degree值，篩選degree值排名前十的靶點構建核心靶點互作網絡(圖5)，圖中節點大小代表該靶點作用強度，degree值越高，節點越大，對應顏色越深；邊的粗細代表靶點間的關聯程度，combine score值越大，靶點間關聯度越高，邊越粗。由此可知，核心靶點互作網絡中包括VEGFA、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL6)、基質金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase 2，MMP2)、PPARG、骨髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(Tyrosine-protein kinase Src，SRC)、KDR、肝細胞生長因子受體(Hepatocyte growth factor receptor，MET)、FABP5、精氨酸酶-1(Arginase-1，ARG1)等重要的CHD相關靶標蛋白，可能在絞股藍治療CHD中發揮主要作用,而且作用機制復雜多樣，非單一蛋白靶標作用而成。

圖4 絞股藍治療CHD潛在靶點互作網絡

圖5 絞股藍治療CHD核心靶點互作網絡

2.5 GO基因功能注釋和KEGG通路富集分析 將43個潛在靶點導入DAVID數據庫進行GO基因功能注釋和KEGG通路富集分析，根據分析結果設定P<0.05，共映射到顯著富集的27條GO條目，包括生物過程(Biological process，BP)、細胞組分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)3個模塊(圖6)。其中，BP主要涉及氨基酸磷酸化、趨化作用、細胞趨化正調控、細胞分裂、呼吸急促正調控等方面；CC主要涉及質膜胞質側外源成分；MF主要涉及ATP結合、蛋白激酶活性、視黃醇X受體結合、鋅離子結合、轉運活性、肝素結合、碳酸鹽脫水酶活性等方面。

圖6 GO基因功能注釋

KEGG通路富集分析(圖7)顯示，絞股藍治療CHD的潛在藥效靶點主要涉及癌蛋白多糖信號通路(proteoglycans in cancer)、癌癥信號通路(pathways in cancer)、磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)、黏著斑(focal adhesion)、黏附連接(adherens junction)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)、血管內皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)等多條信號通路，相關靶基因包括FGFR1、HPSE、VEGFA、MET、MMP2、SRC、KDR、SCD、PPARG、FABP3、FABP4，FABP5、IL6、BCL2等。

圖7 KEGG通路富集分析

2.6 通路圖繪制 將絞股藍治療CHD的43個潛在作用靶點導入KEGG數據庫進行通路分析，經KEGG Mapper工具獲取相關通路注釋，篩選排名靠前的幾條通路進行整合繪制最終通路圖(圖8)，圖中通路涉及靶點標記為淺藍色，絞股藍治療CHD的靶點標記為淺綠色。由此可知，主要涉及pathways in cancer、focal adhesion、PI3K-Akt、Rap1、MAPK、VEGF、Ras、PPAR等信號通路，出現18個絞股藍治療CHD的靶點，RTK、MET、FAK、SRC、VEGF等可在多條通路中發揮作用，表明絞股藍治療CHD的作用機制主要與上述靶點和通路相關，各靶點、通路之間相互協調，共同參與藥理作用的發揮。

圖8 絞股藍治療CHD通路圖

2.7 分子對接結果 選擇主要活性成分及其對應核心靶點作為配體和受體進行分子對接，根據對接得分大小判斷活性成分與靶標蛋白的結合性能，一般分值在6以上表明兩者結合活性較好，分值越高則結合越穩定[12]。如表3所示，大多數活性成分與其核心靶點有著較好的結合活性，部分成分與靶點對接得分較低，可能是由于絞股藍皂苷類成分分子量較大，與靶蛋白的原始小分子配體存在一定差異所致。圖9為絞股藍皂苷XXXV_qt與PPARG(6K0T)的分子對接示意圖，可知兩者主要通過疏水接觸產生相互作用。

表3 絞股藍治療CHD活性成分與其關鍵靶點的分子對接得分值

圖9 絞股藍皂苷XXXV_qt與PPARG(6K0T)的分子對接

3 討論

冠心病(CHD)在中醫學中可歸入“心痛”“胸痹”等范疇，其病位在心，并涉及肝、脾、腎，兼有痰濁、血瘀、氣滯、寒凝等病變[13]。絞股藍性味甘寒、微苦，歸心、脾、肺、腎經，具有養心安神、健脾利胃、清肺化痰、補氣養陰之功[10]。因此，絞股藍在CHD的臨床診療中日益受到關注。本文借助GEO數據庫對CHD的差異表達基因即疾病靶點進行篩選，同時利用網絡藥理學技術，根據多成分、多靶點共同作用的研究思路，對絞股藍治療CHD的活性成分及其作用的分子機制進行系統研究。結果表明，黃酮、植物甾醇及皂苷類成分是絞股藍治療CHD的活性成分，主要包括槲皮素、谷甾醇、波菜甾醇、絞股藍皂苷等。槲皮素具有抗心肌缺血及缺血再灌注損傷、抗動脈粥樣硬化、改善冠狀動脈血循環等多種藥理作用[14-16]；植物甾醇具有顯著的降血脂活性，改善血脂異常可延緩動脈粥樣硬化進程，降低CHD的風險[17]；絞股藍皂苷具有神經保護、抗動脈粥樣硬化、調節糖脂代謝等作用[18-20]，表明本研究結果具有一定可靠性。

通過對絞股藍治療CHD活性成分-作用靶點網絡及PPI網絡進行分析，推斷ESR2、RORA、VDR、KDR、PTGES、PPARG、CDC25B、PTPRF、VEGFA、HPSE、FABP、SCD、IL6、MMP2、MPO、SRC、MET、ARG1等是絞股藍治療CHD的核心靶點。Mansur等[21]認為ESR2是CHD的獨立危險因素。RORA可通過調節脂質代謝、參與炎性反應等機制使TNF-α、IL-6等炎癥因子釋放減少[22]。艾思迪等[23]認為VDR表達降低可能是冠心病的潛在危險因素。KDR是血管內皮細胞VEGF上具有高親和力的酪氨酸受體,主要介導內皮細胞增殖,引起血管通透性升高，活化的KDR能激活PI3K,發揮維持細胞存活效應[24]。VEGFA是至今發現的作用最強、特異性最高的VEGF亞型中最重要的一個因子,具有增加微、小靜脈血管的通透性、促使血管內皮細胞分裂增殖及誘導血管生成再生等作用[25]。Scheller等[26]發現，IL-6表達水平與冠狀動脈嚴重病變的發生率呈正相關，上述結論進一步證實了本研究所得絞股藍治療CHD核心靶點的準確性。

經GO基因功能注釋，發現絞股藍活性成分對氨基酸磷酸化、趨化作用、細胞趨化正調控、細胞分裂、呼吸急促正調控等生物學過程有一定影響，并在絞股藍治療CHD所涉及的作用靶點及相關通路中有所體現。通過KEGG富集分析，證實絞股藍對癌蛋白多糖信號通路、PI3K-Akt信號通路、PPAR信號通路、黏著斑、Rap1信號通路、VEGF信號通路等多條CHD相關信號通路以及VEGFA、MET、MMP2、SRC、KDR、PPARG、FABP、IL6等相關靶點均具有調控作用。PI3K-Akt信號通路[27]、VEGF信號通路[28]、PPAR信號通路[29]、黏著斑激酶介導信號通路[30]等是CHD發生發展中的重要通路，本研究結果表明絞股藍可能通過上述通路發揮對CHD的治療作用，這對絞股藍治療CHD的作用機制研究具有一定意義。

綜上所述，本研究借助GEO數據庫探尋CHD相關靶基因，為CHD的深入研究和臨床治療提供了新思路；利用網絡藥理學方法挖掘絞股藍治療CHD活性成分，通過網絡構建及通路富集闡述了活性成分與作用靶點和通路之間的聯系，揭示了絞股藍治療CHD的潛在分子機制，為絞股藍的臨床應用及深入研究提供了理論基礎；分子對接結果顯示絞股藍活性成分與核心靶點之間結合性能良好，驗證了網絡藥理學預測靶點的準確性。本文研究結果雖得到相關文獻佐證，但未進行實驗驗證，后續可結合本研究結果對絞股藍治療CHD的作用機制進行相關實驗研究，使其藥理作用機制更加明確。