山楂葉總黃酮對高糖誘導的人視網膜微血管內皮細胞增殖和遷移的影響和機制

何玉清， 亢澤峰， 李 凌， 關瑞娟

(1.青海省人民醫院眼科，青海 西寧 810007；2.中國中醫科學院眼科醫院眼科，北京 100040)

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病的一種微血管并發癥，更是導致視力下降的主要原因[1]。視網膜微血管內皮細胞(HRCEC)是血-視網膜內屏障的重要組分，高糖刺激可促進HRCEC增殖和遷移，進而促進新血管形成，導致出血、牽拉性視網膜脫離，最終造成視力喪失[2-3]。因此，降低高糖刺激下HRCEC的增殖和遷移能力有望成為DR治療的新方向。山楂葉總黃酮是從山楂樹葉子中提取的黃酮類化合物的總稱，能有效降低2型糖尿病大鼠血糖，提高機體抗氧化能力，減輕氧化應激損傷[4]，它通過抑制糖尿病大鼠視網膜神經膠質細胞muller激活，提高谷氨酰胺合成酶活性，對糖尿病眼病防治意義重大[5]?；谏鲜鲅芯?，本研究旨在探討山楂葉總黃酮對高糖誘導的HRCEC增殖和遷移的影響及其潛在機制。

1 材料

1.1 細胞 視網膜微血管內皮細胞(HRCEC)，購于美國模式培養物保藏中心。

1.2 試劑與藥物 DMEM培養液(批號907039)、胎牛血清(批號10270-106)購自美國Gibco公司；青鏈霉素雙抗溶液(批號P1400)購自北京索萊寶生物科技有限公司。山楂葉總黃酮(含量≥95%，批號20140213)購于晉城中晉藥業有限公司。VEGF小干擾RNA(si-VEGF)及其陰性對照(si-NC)、PCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；逆轉錄試劑盒(批號RR047A)、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(批號RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司；噻唑藍(MTT)(批號C0009)、兔源Ki67抗體(AF1738)、兔源上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體(AF6759)、兔源神經鈣黏素(N-cadherin)抗體(AF0243)、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體(AF1186)、山羊抗兔IgG(A0208)購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 儀器 MK3型酶標儀，購自美國Thermo公司；iQ5型實時熒光定量PCR儀，購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 細胞培養 HRCEC采用含10%胎牛血清、5%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養液于37 ℃、含5% CO2的恒溫細胞培養箱中培養，按照1∶2比例傳代，每隔2 d換液1次，取對數期HRCEC進行實驗。

2.2 細胞分組和處理 細胞分為對照組，模型組，山楂葉總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組，其中對照組、模型組分別用含25、90 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液處理細胞5 d；山楂葉總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組用含90 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液處理細胞4 d后，分別加入125、250、500 ng/mL山楂葉總黃酮培養液處理24 h。

本實驗將山楂葉總黃酮高劑量+si-NC組為轉染si-NC后，用含90 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液處理細胞4 d，加入500 ng/mL的山楂葉總黃酮的培養液處理24 h；山楂葉總黃酮高劑量+si-VEGF組為轉染si-VEGF后，用含90 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液處理細胞4 d，加入500 ng/mL山楂葉總黃酮的培養液處理24 h。

2.3 MTT法檢測細胞活力 細胞按“2.2”項下方法分組和處理后，取3×103個接種到96孔板，培養24 h后每孔添加20 μL MTT試劑，置于培養箱中孵育4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速搖床振蕩10 min至結晶完全溶解，酶標儀檢測490 nm處各孔光密度(OD)值。

2.4 集落形成實驗檢測克隆形成能力 細胞按“2.2”項下方法分組和處理后，制備單細胞懸液，取200個(5 mL)接種到直徑為60 mm的培養皿中，輕輕晃動培養皿式細胞分散均勻，置于細胞培養箱中培養2周，當培養皿中出現肉眼可見克隆時終止培養，棄去培養液，甲醇固定15 min，吉姆薩染色10 min，顯微鏡下計數大于50個細胞的克隆數。

2.5 Transwell法檢測細胞遷移能力 細胞按“2.2”項下方法分組和處理后，用無血清培養基制備單細胞懸液，取2 000個(200 μL)接種到Transwell上室，取500 μL含10%胎牛血清的培養基加到24孔板下室，置于細胞培養箱中培養24 h，棉拭子擦去未穿膜細胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，顯微鏡下隨機選擇5個視野進行細胞計數，以平均值表示遷移細胞數量。

2.6 蛋白質印記檢測Ki67、E-cadherin、N-cadherin表達 細胞按“2.2”項下方法分組和處理后，RIPA裂解提取總蛋白，測定濃度，取30 μg作聚丙烯酰胺凝膠電泳，按照濕法轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、避光顯影、灰度分析步驟進行操作，以目的蛋白和GAPDH灰度值比值表示目的蛋白表達。

2.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測血管內皮生長因子(VEGF)mRNA表達 細胞按“2.2”項下方法分組和處理后，Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA，利用SYBR Green master mix進行qPCR，以GAPDH為內參，2-ΔΔCT法檢測VEGFmRNA表達。VEGF正向引物5′-AGACCCTCTCCACCAACCAGT-3′，VEGF反向引物5′-TACGACTCGCGTCAACCG-3′；GAPDH正向引物5′-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3′，GAPDH反向引物5′-GAACGGGAAGCTCACTGG-3′。

3 結果

3.1 山楂葉總黃酮對高糖處理的HRCEC增殖的影響 與對照組比較，模型組HRCEC細胞活力、克隆數、Ki67蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，山楂葉總黃酮低、中、高劑量組HRCEC細胞活力、克隆數、Ki67蛋白表達降低(P<0.05)；與山楂葉總黃酮低劑量組比較，山楂葉總黃酮中劑量組HRCEC細胞活力、克隆數、Ki67蛋白表達降低(P<0.05)；與山楂葉總黃酮中劑量組比較，山楂葉總黃酮高劑量組HRCEC細胞活力、克隆數、Ki67蛋白表達降低(P<0.05)。見圖1～2、表1。

圖1 各組HRCEC克隆形成數

圖2 各組Ki67蛋白表達

表1 山楂葉總黃酮對高糖處理的HRCEC增殖的影響

3.2 山楂葉總黃酮對高糖處理的HRCEC遷移的影響 與對照組比較，模型組HRCEC遷移數、N-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組比較，山楂葉總黃酮低、中、高劑量組HRCEC遷移數、N-cadherin蛋白表達降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)；與山楂葉總黃酮低劑量組比較，山楂葉總黃酮中劑量組HRCEC遷移數、N-cadherin蛋白表達降低(P<0.05)；與山楂葉總黃酮中劑量組比較，山楂葉總黃酮高劑量組HRCEC遷移數、N-cadherin蛋白表達降低(P<0.05)。見圖3～4、表2。

圖3 各組HRCEC遷移細胞數

圖4 各組E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

表2 山楂葉總黃酮對高糖處理的HRCEC遷移的影響

3.3 山楂葉總黃酮對高糖處理的HRCEC中VEGF表達的影響 與對照組比較，模型組HRCEC中VEGFmRNA表達升高(P<0.05)；與模型組比較，山楂葉總黃酮低、中、高劑量組HRCEC中VEGFmRNA表達降低(P<0.05)；與山楂葉總黃酮低劑量組比較，山楂葉總黃酮中劑量組HRCEC中VEGFmRNA表達降低(P<0.05)；與山楂葉總黃酮中劑量組比較，山楂葉總黃酮高劑量組HRCEC中VEGFmRNA表達降低(P<0.05)。見表3。

表3 山楂葉總黃酮對高糖處理的HRCEC中VEGF表達的影響

3.4 干擾VEGF增強山楂葉總黃酮對高糖處理的HRCEC增殖的影響 與山楂葉總黃酮高劑量+si-NC組比較，山楂葉總黃酮高劑量+si-VEGF組HRCEC中VEGFmRNA表達、細胞活力、克隆數、Ki67蛋白表達降低(P<0.05)。見圖5～6、表4。

圖5 加入干擾VEGF后各組HRCEC克隆數

圖6 加入干擾VEGF后各組Ki67蛋白表達

表4 干擾VEGF增強山楂葉總黃酮對高糖處理的HRCEC增殖的影響

3.5 干擾VEGF增強山楂葉總黃酮對高糖處理的HRCEC遷移的影響 與山楂葉總黃酮高劑量+si-NC組比較，山楂葉總黃酮高劑量+si-VEGF組HRCEC遷移細胞數、N-cadherin蛋白表達降低，E-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)。見圖7～8、表5。

表5 干擾VEGF增強山楂葉總黃酮對高糖處理的HRCEC遷移的影響

圖7 加入干擾VEGF后各組HRCEC遷移細胞數

4 討論

圖8 加入干擾VEGF后各組E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

研究顯示，山楂葉總黃酮通過改善抗氧化酶活性，提高機體清除自由基能力，降低氧化應激損傷，對糖尿病大鼠腦損傷、肝損傷、胰腺組織損傷具有保護作用[6-8]，還可降低膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及黏附能力[9]。Ki67是一種細胞增殖相關核抗原，與細胞的有絲分裂密切相關，其表達是反應細胞增殖能力和活躍程度的重要指標[10]。E-cadherin和N-cadherin是鈣離子依賴的細胞粘附素家族成員，對維持細胞極性和完整性具有重要作用，E-cadherin表達缺失、N-cadherin表達增加可促進細胞侵襲轉移[11]。本研究顯示，高糖刺激后HRCEC中Ki67和E-cadherin蛋白表達、細胞活力、克隆形成數、遷移細胞數明顯升高，N-cadherin蛋白表達顯著降低，而山楂葉總黃酮呈劑量依賴性地降低HRCEC活力、克隆形成和遷移能力，促進Ki67和E-cadherin蛋白表達，提示山楂葉總黃酮可抑制高糖誘導的HRCEC的增殖、遷移和侵襲。

VEGF一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，其通過與內皮細胞膜上VEGF受體結合，激活下游絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號通路，誘導內皮細胞生長和血管增生[12]。研究顯示，DR患者視網膜組織中VEGF高表達與視網膜新生血管形成密切相關，抑制VEGF表達可誘導HRCEC細胞周期阻滯，發揮抗增殖作用[13-14]。此外，抑制瞬時受體電位陽離子通道(TRPC)對高糖誘導的HRCEC增殖、遷移和管腔形成的阻礙作用可能與抑制VEGF表達有關[3]。本研究顯示，高糖刺激后HRCEC中VEGFmRNA表達明顯升高，而山楂葉總黃酮呈劑量依賴性地抑制高糖誘導的VEGFmRNA表達，干擾VEGF表達可增強山楂葉總黃酮對高糖處理的HRCEC增殖、遷移的抑制作用。

綜上所述，山楂葉總黃酮可通過下調VEGF表達抑制高糖誘導的HRCEC增殖和遷移，能為關于該成分防治DR的研究奠定理論基礎。