山楂、決明子、澤瀉提取物對高脂血癥大鼠血脂水平、肝功能及HMGCR表達的影響

胡慧明， 朱彥陳， 于城安， 袁 斌， 陳笑天， 官 揚， 鄧雅瓊， 邵 峰*

(1.江西中醫藥大學科技學院，江西 南昌 330004；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004)

高脂血癥又稱為血脂異常，是一種中老年人最常見的全身性疾病，它是誘發脂肪肝、肥胖、高黏血癥、高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病、冠心病及腦卒中等心腦血管疾病的重要危險因素[1-3]。近年來，調脂中藥受到了廣泛的認可與青睞，其特點在于食用安全，作用多途徑、多靶點，藥效溫和，適于長期服用。

臨床上高脂血癥主要采用益氣健脾、疏肝理氣、補益肝腎等方法治療[4]，肝主疏泄，氣機調暢，有助于脾的運化和升清，是瘀血形成的重要環節；脾主運化升清，又有助于肝的疏泄升發，為“生痰之源”；腎主水化氣，為先天之本，對五臟的功能具有調節作用，調節主持全身水液輸布[5]，若脾失運化、肝失疏泄、腎失氣化，則氣血運行不暢，津液內停，化生膏脂，故應從肝、脾、腎辨證入手，通過健脾化痰、祛瘀、滋補肝腎以調脂[6-7]，可更好地提高臨床療效。

決明子具有清肝明目、滋益肝腎之功效，山楂能健脾開胃、行氣散瘀，澤瀉又可利水滲濕、泄熱通淋，正是從肝脾腎角度論治，均對高血脂癥有明顯的療效[8-10]，臨床應用廣泛，但三藥合用的調脂保肝作用及機制尚未見報道。因此，本實驗采用高脂飼料喂養大鼠模擬人類不良飲食習慣建立高脂血癥模型，考察山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠血脂水平、肝功能及HMGCR表達的影響，并探討其潛在作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠40只，體質量180～220 g，購于江西中醫藥大學實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK(贛)2018-0003。飼養條件為溫度22～26 ℃，相對濕度60%～70%，每日更換水和飼料。

1.2 試劑與藥物 山楂提取物(粉末狀，標準水提工藝，即藥材粉碎→投料→水浸泡→提取→濃縮→噴霧干燥→滅菌→過篩→粉末)(批號 ZLSC19010401)、決明子提取物(粉末狀，標準水提工藝，操作同山楂提取物)(批號ZLSC18121003)、澤瀉提取物(粉末狀，標準水提工藝，操作同山楂提取物)(批號ZLSC18101305)均購自南京澤朗生物科技有限公司。辛伐他汀片，購自天津懷仁制藥有限公司(批號20180605)。高脂飼料(豬油10%、膽固醇2%、三號膽鹽1%、蛋黃粉10%)，購自南通特洛菲飼料科技有限公司(批號19040106)?？偰懝檀?TC)試劑盒(批號 2019011501)、甘油三酯(TG)試劑盒(批號 2018091801)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號 2018091901)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號2018082701)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)測定試劑盒(批號 2018121103)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測定試劑盒(批號 2018111401)，均購自安徽伊普諾康生物科技股份有限公司；羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)抗體，購自南京恩晶生物科技有限公司(批號 H15F07)。

1.3 儀器 AU480全自動生化分析儀(美國Beckman Coulter公司)；Dako CoverStainer組織染色機(丹麥Dako Denmark A/S公司)；HI1210攤片機、DM1000生物顯微鏡(德國Leica公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫療器械有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備 將3種提取物按1∶1∶1比例混合，蒸餾水分別配制成0.1、0.3 g/mL混懸液；辛伐他汀片給藥前，蒸餾水配制成1 mg/mL混懸液。

2.2 分組、造模及給藥 將40只大鼠隨機分為正常對照組，模型對照組[根據2015年版《中國藥典》3味藥材的成人推薦劑量(每天9 g)進行動物給藥劑量換算(成人按照60 kg計算，折算成大鼠劑量約為1 g/kg)]，山楂、決明子、澤瀉提取物低劑量組(1 g/kg)，山楂、決明子、澤瀉提取物高劑量組(3 g/kg)，陽性對照組(辛伐他汀，10 mg/kg)，每組8只，正常對照組大鼠給予基礎飼料，其他各組大鼠給予高脂飼料[11]，實驗期間自由采食飲水，連續5周。同時，各組大鼠每天灌胃給予相應藥物，容量1 mL/100 g，每天1次，連續5周，正常對照組、模型對照組大鼠灌胃給予相應體積的蒸餾水。

2.3 標本采集、指標檢測 分別于造模給藥2、5周后，各組大鼠眼眶取血0.8 mL，3 500 r/min離心10 min，取血清，全自動生化儀檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平。

2.4 肝臟病理形態學觀察 末次給藥采血完畢后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g)麻醉，解剖取肝臟，甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，HE染色，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察病理變化，每張病理切片取3個視野進行評分[12-13]，其中肝細胞形態整齊，肝細胞索排列整齊，肝竇清晰，無脂肪變性，無炎癥細胞浸潤等病理改變，為0分；肝細胞索排列紊亂，偶見脂滴空泡，有輕微的炎性浸潤，為1分；肝細胞有輕度腫脹，較多脂滴空泡和炎性浸潤，為2分；肝竇消失，肝細胞重度腫脹，有大量脂滴空泡和炎性浸潤，為3分。

2.5 肝組織HMGCR檢測 采用免疫組化法，在光學顯微鏡下觀察拍照，應用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件，根據染色面積和強度進行半定量分析，HMGCR平均光密度值=積分光密度(IOD)/面積(Area)。

3 結果

3.1 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠血脂水平的影響 與正常對照組比較，高脂飼料喂養2、5周后，模型對照組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01)，HDL-C水平降低(P<0.01)；與模型對照組比較，給藥2、5周后，山楂、決明子、澤瀉提取物1 g/kg劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05,P<0.01)，HDL-C水平升高(P<0.01)；3 g/kg劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.01)，HDL-C水平升高(P<0.01)；辛伐他汀組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.01)，HDL-C水平升高(P<0.01)。見圖1～2。

注：與正常對照組比較，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與正常對照組比較，##P<0.01；與模型對照組比較，**P<0.01。

3.2 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠血清ALT、AST水平的影響 與正常對照組比較，高脂飼料喂養2、5周后，模型對照組大鼠血清ALT、AST水平升高(P<0.01)；與模型對照組比較，給藥2、5周后，山楂、決明子、澤瀉提取物1 g/kg劑量組大鼠血清ALT、AST水平降低(P<0.05,P<0.01)；3 g/kg劑量組大鼠血清ALT、AST水平降低(P<0.01)；辛伐他汀組大鼠血清ALT、AST有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：與正常對照組比較，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 肝組織病理形態學變化 正常對照組大鼠肝組織形態學正常，肝細胞分界清楚，匯管區完整清晰，肝細胞排列緊密整齊，肝竇清晰可見，肝細胞索呈放射狀排列，肝細胞多邊形，肝細胞未見變性；模型對照組大鼠正常肝組織結構消失，肝小葉結構破壞，細胞索排列紊亂，大部分肝竇消失，脂滴空泡較多，肝細胞重度腫脹，出現彌漫性肝細胞氣球樣變，大量炎性細胞浸潤；山楂、決明子、澤瀉提取物組大鼠肝組織氣球樣變、腫脹程度減輕，部分肝竇清晰可見，細胞內匯管區炎細胞浸潤減輕，范圍明顯減小、辛伐他汀給藥組大鼠脂滴空泡減少，肝組織氣球樣變、腫脹程度減輕，肝細胞內匯管區偶見部分炎性細胞浸潤。見表1、圖4。

表1 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠肝臟病理評分的影響

圖4 各組大鼠肝組織形態學(HE，×200)

3.4 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠肝組織HMGCR表達的影響 正常對照組大鼠偶見肝細胞胞漿褐色陽性表達；模型對照組大鼠多數肝細胞胞漿棕褐色陽性表達；山楂、決明子、澤瀉提取物1 g/kg劑量組大鼠部分肝細胞胞漿淡褐色陽性表達；3 g/kg劑量組、辛伐他汀組大鼠少數肝細胞胞漿淡褐色陽性表達。與正常對照組比較，模型對照組大鼠HMGCR陽性表達升高(P<0.01)；與模型對照組比較，各用藥組HMGCR陽性表達下降(P<0.01)。見表2、圖5。

表2 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠肝組織HMGCR表達的影響

圖5 各組大鼠肝組織HMGCR表達(免疫組化，×200)

4 討論

高脂血癥是指血液中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)增高，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低[14]，該病臨床表現為高膽固醇血癥，高甘油三脂血癥或兩者兼有(混合型高脂血癥)。

中醫認為，高脂血癥乃因肝脾腎三臟功能失調[4]，病機主要是由于脾腎虛損，肝失疏泄，從而導致全身氣機升降失常，水液代謝障礙，致使氣滯血瘀，痰濁內生、濁陰不用，化為膏脂，進而導致高脂血癥的產生[15]。山楂、決明子、澤瀉提取物中山楂具有健脾開胃、行氣散瘀之功效，決明子能清肝明目、滋益肝腎，澤瀉具有利水滲濕、泄熱通淋之功效，三者合用，整體調節，共奏肝脾腎三臟同治之效。本研究結果顯示，山楂、決明子、澤瀉提取物能改善高脂血癥模型大鼠血脂水平，降低血清TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平；同時還能降低ALT、AST水平，并減輕肝組織氣球樣變、腫脹程度，改善炎癥細胞浸潤。提示其具有一定的調脂保肝作用。

體內獲得膽固醇的兩條途徑是肝臟膽固醇的內源性自身合成以及小腸從食物中的吸收，其中肝臟合成的膽固醇是機體膽固醇最主要的來源。HMGCR是肝臟合成膽固醇的限速酶[16-17]，HMGCR表達上調則體內膽固醇合成增多，臨床上他汀類藥物是通過抑制HMGCR活性來產生降血脂作用的[18]。因此，抑制HMGCR則能減少體內膽固醇的合成，從而調節血脂代謝。本研究結果顯示，與模型對照組比較，山楂、決明子、澤瀉提取物不同劑量組大鼠肝組織HMGCR表達明顯下調，提示其可能是山楂、決明子、澤瀉提取物產生調血脂作用的重要靶點。

綜上所述，山楂、決明子、澤瀉提取物從肝脾腎同治角度能降低高脂血癥模型大鼠血脂水平，改善肝功能，減輕肝臟脂肪變性，其作用機制可能是與下調HMGCR表達有關，但也可能存在其他作用靶點，有待進一步研究。同時三藥合用在臨床選藥與用藥劑量方面也起到了一定的指導作用，將為臨床防治高脂血癥提供客觀依據和新思路。