鼻敏通竅方對變應性鼻炎模型小鼠IgE和EOS的影響

丁元元， 趙 霞*， 邢瓊瓊， 董盈妹， 紀建建， 梁眾擎

[1.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫藥大學中醫兒科研究所，江蘇省兒童呼吸疾病(中醫藥)重點實驗室，江蘇 南京 210023]

兒童變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)屬中醫“鼻鼽”范疇，是一種以突然鼻癢、打噴嚏、流涕和鼻塞為主要臨床表現的過敏性疾病，其對小兒生活質量、成長健康及心理狀態的負面影響持久而深遠[1]。兒童過敏性疾病的負擔已成為醫療保健系統面臨的主要挑戰之一[2]。近年變應性鼻炎日趨成為兒童主要的呼吸道慢性疾病[3]，由于兒童自身的特性，變應性鼻炎的鼻塞癥狀難以持久改善，對患兒的成長及頜面部發育會產生終身影響[4]，現西藥治療變應性鼻炎以類固醇制劑、抗組胺類藥物和白三烯抑制劑為主，有作用靶點單一、療效短暫、副作用較多缺陷。中國的兒科人群中使用中藥的比例很高[5]，大量的臨床研究已經證明中醫藥治療變應性鼻炎安全有效[6]，中醫藥對癥治療獨具優勢。鼻敏通竅方在臨床應用多年，其療效穩定、持久，尤可長效改善鼻塞癥狀，臨床療效顯著。本實驗通過建立變應性鼻炎動物模型，從免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)和嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)的角度，初步探討鼻敏通竅方治療小兒變應性鼻炎的作用機理。

1 材料

1.1 動物 BALB/c小鼠50只，體質量18～22 g，雌性，SPF級，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，動物生產許可證號SCXK(蘇)2017-0001。

1.2 藥物 鼻敏通竅方，由蒼耳子6 g、辛夷6 g(包煎)、川芎6 g、白芷10 g、防風6 g、白芍10 g、烏梅10 g、生石膏15 g組成，由北京同仁堂有限公司南京店提供，經南京中醫藥大學中藥鑒定教研室劉圣金副教授鑒定為正品，藥材依次加8、6倍量水浸泡1 h后煮沸2次，每次約30 min，過濾后并濃縮濾液至2 g/mL，裝于無菌瓶中，置于4 ℃冰箱中冷藏備用。孟魯司特鈉顆粒，購自杭州默沙東制藥有限公司，批號J20140167，蒸餾水溶解，現配現用。

1.3 儀器 ELX800酶標儀，購自美國BioTek公司；電子分析天平(CPA2250)，購自德國Sartorius公司；-80 ℃超低溫冰箱，購自美國Thermo公司；移液器，購自德國Eppendorf公司；恒溫振蕩儀(THZ-C)，購自太倉市強樂實驗設備有限公司；高速冷凍離心機，購自德國Eppendorf公司；Accuri C6 Plus流式細胞計數儀，購自美國BD公司。

1.4 試劑 氫氧化鋁凝膠，購自西安赫特科技有限公司；卵清蛋白(OVA grade V)，購自美國Sigma公司；小鼠外周血淋巴細胞分離液，購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，批號LTS1092-200；流式熒光表面抗體CD11C-FITC、Siglec-F-APC(鼠抗)，購自美國eBioscience公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，購自上海源培生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 50只小鼠適應性飼養3 d后，隨機分為空白組(8只)、模型組(8只)、孟魯司特鈉組(8只)、鼻敏通竅方低劑量組(8只)、鼻敏通竅方中劑量組(9只)，鼻敏通竅方高劑量組(9只)，參考文獻[7]報道建立小鼠變應性鼻炎模型。除空白組外，各組小鼠在第0、7、14天腹腔注射0.2 mL致敏液(含OVA 40 μg、氫氧化鋁凝膠1.5 mg，溶于生理鹽水中)，第21天雙側滴鼻OVA溶液(含200 μg OVA)40 μL/只，連續7 d，正常組小鼠以同體積0.9%氯化鈉溶液代替。每次滴鼻激發5 h后，空白組，模型組，鼻敏通竅方高、中、低劑量組(2、1.5、1 g/mL)，孟魯司特鈉組(1.35 mg/kg)小鼠每天灌胃給藥1次，共7 d。

2.2 樣品制備 小鼠末次灌胃給藥、禁食不禁水24 h后，摘除眼球取血，3 000 r/min離心10 min，取上清保存于-80 ℃冰箱中，外周血加入小鼠淋巴細胞分離液，梯度離心法分離收集PBMC。脫頸椎處死小鼠，取鼻黏膜組織，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，病理切片進行HE染色。

2.3 指標檢測 ELISA法檢測小鼠血清中IgE水平，相關試劑盒由杭州聯科生物技術股份有限公司提供，操作嚴格按要求進行。分離出的PBMC用PBS緩沖液洗滌，離心，重懸，加入流式熒光抗體Siglec-F-APC，CD11c-FITC標記，篩網過濾后5 min內上機檢測，分析EOS比例。

3 結果

3.1 行為學評分 在小鼠末次鼻腔激發致敏后立即觀察30 min，記錄噴嚏、流涕、抓鼻情況，疊加量化計分法計分，總分超過5分表示造模成功，評分標準[8]見表1，結果見圖1。由此可知，模型組小鼠癥狀行為學評分高于空白組(P<0.05)，孟魯司特鈉組、鼻敏通竅方組小鼠癥狀行為學評分低于模型組(P<0.05)。

表1 行為學評分標準

3.2 小鼠鼻黏膜病理學變化

3.2.1 鼻黏膜組織病理學評分 由病理讀片工作人員隨機觀察各組4個高倍視野下EOS、肥大細胞等炎性細胞、纖毛、杯狀細胞情況，以及黏膜下層腺體肥大、增生程度及黏膜上皮完整性，并進行分級評分，評定標準見表2，結果見圖2。由此可知，模型組顯示病理評分高于空白組(P<0.05)，孟魯司特鈉組、鼻敏通竅方中劑量組小鼠病理評分低于模型組(P<0.05)。

注：與空白組比較， #P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

表2 鼻黏膜組織病理學評分標準

3.2.2 鼻黏膜組織HE染色及EOS計數 與空白組比較，模型組小鼠鼻黏膜纖毛柱狀上皮細胞排列紊亂，缺乏完整性，纖毛大量脫落，固有層腺體增生明顯，并伴有大量炎性細胞的滲出；與模型組比較，鼻敏通竅方組小鼠纖毛柱狀上皮細胞排列整齊，偶有脫落，有少量炎性滲出，而孟魯司特鈉組小鼠可見上皮細胞脫落，腺體增生，有少量炎性滲出，見圖3A。隨機選取3個不同視野(HE，×400)觀察，發現模型組EOS計數高于空白組(P<0.05)；孟魯司特鈉組、鼻敏通竅方組EOS計數低于模型組(P<0.05)，見圖3B。

注：黃色箭頭處為大量性細胞浸潤，紅色箭頭處為固有層腺體增生，黑色箭頭處為上皮細胞脫落。與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.3 小鼠外周血IgE表達 模型組小鼠IgE表達高于空白組(P<0.05)，孟魯司特鈉組、鼻敏通竅方組小鼠IgE表達低于模型組(P<0.05)，見圖4。

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.4 小鼠PBMC中EOS比例 模型組小鼠EOS比例高于空白組(P<0.05)，鼻敏通竅方組小鼠EOS比例低于模型組(P<0.05)，見圖5。

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

4 討論

變應性鼻炎是兒童最常見的過敏性疾病之一。主要由IgE介導，即特應性個體吸入過敏原后，過激產生IgE抗體，與各類免疫細胞如EOS、肥大細胞等表面抗體結合，使免疫細胞過度活化，致機體處于致敏狀態，釋放多種炎性介質，而導致鼻黏膜非感染性慢性炎性浸潤[6]。多年相關研究證實IgE是過敏反應的核心介導，總IgE增加已經成為AR主要的診斷標準和治療靶標[9]。

AR是一種以Th2過度分化為主的鼻黏膜免疫疾病，Th2細胞因子的過量產生和鼻黏膜組織中與過敏相關促炎細胞的大量浸潤，導致機體免疫調節功能異常[10]。AR存在速發相和遲發相反應，鼻塞在兩者中都是顯著的癥狀[11]。鼻腔黏膜在過敏原反復刺激下，肥大細胞和EOS等炎性細胞聚集鼻腔，導致黏膜腫脹[12]。EOS在變應性鼻炎的生理病理中起著重要的作用[13]，是人類過敏性疾病中重要的效應細胞，可釋放促炎介質，在過敏性鼻炎患者的血常規中，EOS數量升高[14]。鼻黏膜EOS積累是導致鼻腔黏膜慢性持續炎癥的重要因素。近年研究發現，EOS是一種多功能的白細胞，它參與維持組織的動態平衡、調節針對特定微生物的適應性和固有免疫應答[15]。變應性疾病的抗原呈遞細胞不僅激活Th2細胞，也分泌促炎癥反應介質，這些因子可誘發上皮細胞產生趨化因子吸引EOS[16]。

祖國醫學很早就已經認識到AR的發病與自然環境、氣候、人體存在密切的關系，中醫認為小兒鼻鼽的發病，除冒受外風、異氣，伏風內潛之外，還與患兒肺、脾、腎三臟功能失調密切相關[17]。其病理因素主要為風和痰。小兒肺常不足，氣候交替，環境改變之時，異稟質小兒因風邪侵襲而肺失宣降，津液失布；小兒脾常不足，易聚濕為痰；小兒腎常不足，痰根難祛，而致風痰博結，阻礙津液正常運化，使其發生代謝異常，因此出現鼻癢，噴嚏，流涕，鼻塞反復發作無常。鼻敏通竅方主要由蒼耳子、辛夷、川芎、白芷、防風、白芍、烏梅、生石膏組成。方中蒼耳子、辛夷、白芷有辛陽發散、宣風通竅之功；川芎辛溫香竄，活血行氣，祛風止痛，可除久病留瘀，祛風同時配伍活血之藥，取“治風先治血，血行風自滅”之意，以利風邪消散；白芍、烏梅能滋陰和營，斂津澀涕，又防辛溫之藥發散太過而耗傷小兒氣津；防風為風中潤劑，性甘潤，既能祛風發表止癢，宣肺氣，又有升陽運脾化痰之功，與烏梅組成藥對，祛風抗過敏[18]，甘酸斂肺生津，可順接臟腑陰陽之氣；生石膏清肺之郁熱。全方祛風行氣化痰，驅邪不傷津，斂液不留邪，平衡小兒陰陽。全方配伍根據小兒用藥特點，遵從中醫整體觀念和辨證施治原則，謹守病機，標本兼顧，共奏祛風化痰通竅之效，在臨床上獲得了持久而顯著的療效。

本實驗研究發現，變應性鼻炎小鼠模型體內IgE維持高水平狀態，而循環EOS也呈現高表達；變應性鼻炎模型組小鼠鼻黏膜纖毛柱狀上皮細胞結構破壞嚴重，而鼻敏通竅方組小鼠鼻黏膜上皮細胞結構的破壞有所改善。這些結果表明，小兒變應性鼻炎慢性炎癥持續存在，鼻敏通竅方能夠下調IgE的合成，減少EOS的浸潤，維護鼻黏膜纖毛柱狀上皮細胞的完整性，而發揮免疫調節效應，改善鼻部慢性炎癥，減輕變應性鼻炎的發作。基于本次實驗結果，下一步擬采用分子生物學技術，從EOS過度活化的角度出發，篩選出能影響EOS活化的趨化因子，進一步揭示鼻敏通竅方對兒童變應性鼻炎治療的作用機理，開拓中醫藥防治小兒變應性鼻炎的新思路。