杞菊地黃口服液中熟地黃原料的質量控制

吳 芳， 羅定強， 樊寶娟， 楊海燕， 戴 涌， 劉海靜

(陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710061)

地黃為玄參科植物地黃RehmanmiaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根，性寒，重于清熱涼血，養陰生津，經炮制成熟地黃后由寒轉溫，功效由清轉補，重于補血滋陰、益精填髓[1]。現代研究表明，熟地黃具有其他多種藥理作用[2-7]，生熟之品藥性迥異。

目前，熟地黃炮制的溫度、時間等工藝參數尚無嚴格的規定，實際生產過程中判定炮制是否完全及與生地黃進行區分主要依靠顏色、質地等感官指標，但熟地黃的質量控制必須依賴現代分析儀器及量化指標。2020年版《中國藥典》收載的大約130個中藥制劑中含有熟地黃，但僅有少數在其檢驗項目列入了顯微鑒別和薄層色譜鑒別。近年來，研究熟地黃化學成分[8-11]及其含量動態變化[12-15]的報道較多，但尚未見制劑中熟地黃原料的報道，本實驗參考文獻[11-12]模擬熟地黃的炮制過程，選擇甘露三糖、水蘇糖作為指標成分，測定了部分飲片及杞菊地黃口服液中兩者含量，以期為該藥材質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，配置Alltech ELSD 3300 ES 蒸發光散射檢測器，購自美國Waters公司；BP211D、BS224S電子分析天平，購自德國賽多利斯公司；KQ-500DE超聲波清洗儀，購自昆山市超聲儀器有限公司；高速勻漿機，購自德國IKA公司。

1.2 試劑 水蘇糖對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號112031-201701，純度90.5%)；甘露三糖對照品(上海同田生物技術有限公司，CAS號13382-86-0，E-2856，以98.0%計)。生地黃、熟地黃對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為121180-201105、121196-201105)。水為高純水；乙腈為色譜純(美國Avantor Penformance Materials公司)。

1.3 藥物與藥材 65批杞菊地黃口服液來自市場；按照處方和工藝，使用合格飲片自制的陽性樣品1批、不含熟地黃的陰性樣品1批；生地黃飲片(編號生地黃1～生地黃7)、熟地黃飲片(編號熟地黃1～熟地黃8)購自連鎖藥店及市場。鮮地黃采自陜西西安長安區，經陜西省食品藥品檢驗研究院羅定強主任藥師鑒定為玄參科植物地黃RehmanmiaglutinosaLibosch.的塊根，切片，緩緩烘焙至八成干，按炮制規范要求加熱蒸制，蒸制過程中每隔4 h取樣1次，共8次。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Carbohydrate色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，PN 840300-908)；流動相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～5 min，90%A；5～65 min，90%～65%A)；體積流量0.8 mL/min；柱溫35 ℃；蒸發光散射檢測器；漂移管溫度95 ℃；氣體體積流量3.0 L/min。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取甘露三糖、水蘇糖對照品適量，加水制成質量濃度分別為0.806 5、1.945 8 mg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取炮制品適量，粉碎成粗粉，精密稱取2 g，置于錐形瓶中，精密加入50 mL水浸泡1 h，高速勻漿機處理1 min后超聲提取30 min，離心，取上清液，即得(必要時進行稀釋)。另取口服液、自制陽性樣品、不含熟地黃的陰性樣品適量，搖勻，各精密量取3 mL(含熟地黃約1.95 g)，加水至10 mL，搖勻，濾過，即得。

2.3 專屬性試驗 吸取“2.2”項下供試品溶液各5 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，陰性樣品色譜圖中在甘露三糖、水蘇糖對照品色譜峰保留時間一致的位置上未發現色譜峰，表明該方法專屬性良好。

1.甘露三糖 2.水蘇糖

2.4 線性關系考察 分別稱取甘露三糖、水蘇糖對照品41.15、107.50 mg，置于10 mL量瓶中，加水制成質量濃度分別為4.032 7、9.728 8 mg/mL的對照品溶液，稀釋成系列質量濃度，在“2.1”項色譜條件下各進樣5 μL測定。以峰面積對數值為縱坐標(Y)，對照品質量濃度的對數值為橫坐標(X)進行回歸，得到甘露三糖、水蘇糖方程分別為Y=1.20X+5.98(r=0.999 8)、Y=1.08X+6.11(r=0.999 9)，分別在0.161 3～4.032 7、0.389 2～9.728 8 mg/mL范圍內線性關系良好。另外，兩者檢測限分別為0.18、0.22 mg/mL。

2.5 精密度試驗 取甘露三糖、水蘇糖質量濃度分別為0.806 5、1.945 8 mg/mL的對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得兩者峰面積RSD分別為2.6%、2.7%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取熟地黃(編號5)適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得甘露三糖、水蘇糖含量RSD分別為3.0%、3.5%；取口服液(批號170701)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得兩者含量RSD分別為0.20%、2.5%，表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

2.7.1 熟地黃 取熟地黃(編號5)適量，粉碎成粗粉，精密稱取6份，每份1 g，精密加入對照品溶液(甘露三糖、水蘇糖質量濃度分別為197.098、13.325 mg/mL)各1 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表1。

表1 熟地黃中各成分加樣回收率試驗結果(n=6)

2.7.2 杞菊地黃口服液 精密量取口服液(批號170701)1.5 mL，精密加入對照品溶液(甘露三糖、水蘇糖質量濃度分別為2.927、1.042 mg/mL)各1 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

表2 杞菊地黃口服液中各成分加樣回收率試驗結果(n=6)

2.8 樣品含量測定 地黃飲片中甘露三糖、水蘇糖含量測定結果見表3，可知65批口服液中兩者質量分數范圍分別為0～4.04、0～10.2 mg/mL。

表3 各成分含量測定結果

4 討論

熟地黃炮制時要求反復蒸曬[8]，直至“色黑如漆，味甘如飴”[16]。本實驗結果顯示，炮制可使水蘇糖含量逐漸降低，甘露三糖含量逐漸升高，同時顏色由黃棕色逐漸加深變黑，味道甜度增加，當蒸制約20 h時，熟地黃表面及斷面呈烏黑色，柔軟有光澤，黏性大，按法定標準檢驗符合規定，此時水蘇糖、甘露三糖含量比值約為0.1。7批生地黃中水蘇糖、甘露三糖含量比值約為4.6～11.4，僅有1批小于5.0，其斷面顏色為黑棕色，其余均大于7；8批熟地黃中兩者比值為0.06～0.29，僅有1批大于0.20，其較大塊的斷面可見少量黃心，可能炮制不完全。

熟地黃飲片質韌軟黏，不易粉碎成細粉。本實驗對比了粉碎成粗粉再高速勻漿處理、直接粉碎以及冷凍后粉碎3種處理方法，結果第1種方法簡便，易操作，各成分含量較高，重復性好，故選擇其作為供試液的制備方法。

甘露三糖為熟地黃中特有的活性成分，在炮制過程中由水蘇糖轉化而來[16]，含量較高，藥效確切。本實驗證明了依據甘露三糖、水蘇糖的含量及其比值為指標來判斷炮制程度和區分生熟地黃，其結論與采用感觀判斷方法得到的結論相一致。

65批杞菊地黃口服液中，有12批未檢出甘露三糖和水蘇糖，提示該12批樣品可能使用提取過有效成分的熟地黃藥渣或者再生的熟地黃[17]進行投料；另外有16批樣品中水蘇糖的含量大于甘露三糖(兩者比值為2.0～3.3)，提示熟地黃原料可能炮制不完全。研究結果表明，該制劑的質量標準需要進行提升。