葒草苷調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定以促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生

錢 浩， 林 芝#， 周佳瑛， 賴嘉新， 吳志炫， 黃 溶， 黃蕾蕾， 董晨琳，陳子怡， 王 特*

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，溫州醫(yī)科大學(xué)育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，溫州醫(yī)科大學(xué)信息與工程學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)預(yù)后不良并伴有一系列并發(fā)癥[1]。與周圍神經(jīng)系統(tǒng)或胚胎期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同，成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)生損傷后，軸突再生極為有限[2-3]。軸突再生障礙主要由神經(jīng)元發(fā)育成熟過程中本身生長動力的減弱以及損傷后抑制性細(xì)胞微環(huán)境的形成所導(dǎo)致，這也是脊髓損傷預(yù)后不良的關(guān)鍵與治療的難點(diǎn)[4]。近年來，細(xì)胞骨架動力學(xué)作為軸突再生的關(guān)鍵因素受到廣泛關(guān)注。微管作為細(xì)胞骨架的關(guān)鍵組分，在正常神經(jīng)元中，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，平行排列并聚集成束，并延伸至軸突末端參與組成生長錐，進(jìn)而參與軸突生長[5]；而脊髓損傷后，微管的穩(wěn)定性被打破，軸突再生被顯著抑制[6]。多項(xiàng)研究表明，通過藥理作用增加微管穩(wěn)定性能夠激活軸突再生潛能從而改善脊髓損傷后的運(yùn)功功能，促進(jìn)恢復(fù)，因此調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性可作為脊髓損傷治療的重要研究方向[7-8]。葒草苷(Orientin，ORT)是一種C-糖基類黃酮，主要提取自剛竹屬竹葉、圣羅勒、西番蓮、烏蕨和金蓮花等藥用植物中。根據(jù)已有研究報(bào)道，葒草苷具有神經(jīng)保護(hù)、抗心肌缺血、抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[9-12]。但葒草苷在脊髓損傷模型中尚未報(bào)道，其治療功能不明，作用機(jī)制不清。本研究發(fā)現(xiàn)：葒草苷給藥可以穩(wěn)定微管以激活軸突再生潛能，從而促進(jìn)脊髓損傷大鼠的運(yùn)動功能恢復(fù)，表明葒草苷具有作為治療脊髓損傷候選藥物的潛力。

1 材料

1.1 動物 成年雌性SD大鼠8周齡，體質(zhì)量220～230 g，共36只，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司)，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2017-0005。

1.2 藥物與試劑 葒草苷(純度≥98%，CAS號28608-75-5，批號MUST-19071508)對照品購自成都曼思特生物科技有限公司。CCK-8試劑盒(貨號CA1210)、胰蛋白酶-EDTA消化液(貨號T1320)、DAPI復(fù)染試劑(貨號D8200)購自北京索萊寶科技有限公司；Hank’s緩沖液(貨號13150016)、DMEM/F-12培養(yǎng)基(貨號11320033)、神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基(貨號21103049)、TRIzol試劑(貨號15596018)、2% B27(貨號17504044)、0.5 mmol/LL-谷氨酰胺(貨號21051024)、胎牛血清(貨號10100147)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；兔抗GAP43抗體(貨號ab16053)、兔抗Tuj-1抗體(貨號ab18207)、兔抗GAPDH抗體(貨號ab9485)、兔抗Ace-tubulin抗體(貨號ab179484)、兔抗GFAP抗體(貨號ab7260)購自英國Abcam公司；兔抗Tyr-tubulin抗體(貨號MAB1864-I)購自美國Sigma-Aldrich公司；BCA試劑盒(貨號P0012)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 Thermo 8000系列水套式3429 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、ABI QuantStudio5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientifie公司)；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；Western blot電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；ECLIPSE 80i 共聚焦熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)及氧糖剝奪模型建立 原代神經(jīng)元提取自新生SD乳鼠，皮質(zhì)與大腦剝離、清理血管后，將皮質(zhì)組織剪切成小塊，置于預(yù)冷的Hank’s緩沖液中，在37 ℃下用0.125%胰蛋白酶-EDTA處理25 min，溶液用100 μm細(xì)胞過濾器過濾，1 000 r/min離心5 min。細(xì)胞沉淀重懸于完全DMEM/F-12培養(yǎng)基中，并放置在37 ℃下含5% CO2、空氣濕潤的培養(yǎng)箱中孵育，4 h后將培養(yǎng)基更換為含有2% B27、0.5 mmol/LL-谷氨酰胺的神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基，繼續(xù)在上述條件中培養(yǎng)，每隔3 d更換1次培養(yǎng)基。氧糖剝奪(OGD)處理細(xì)胞，模擬體外脊髓損傷，吸取神經(jīng)元細(xì)胞原有的培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入無糖DMEM培養(yǎng)基，置于三氣孵育培養(yǎng)箱[O2/CO2/N2(1%/5%/94%)]中處理，使細(xì)胞處于氧糖剝奪狀態(tài)，將神經(jīng)元細(xì)胞置于氧糖剝奪(OGD)環(huán)境中作用6 h，同時(shí)不給予或給予不同濃度葒草苷處理48 h。根據(jù)以上處理因素將細(xì)胞分為空白對照組、OGD組、OGD+葒草苷組，進(jìn)行CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測、RT-qPCR、免疫熒光染色、Western Blot分析。

2.2 葒草苷細(xì)胞毒性檢測 將100 μL神經(jīng)元懸液置于96孔板中，孵育24 h后，向各孔中加入不同濃度(0、2.5、5、10、25、50 μmol/L)葒草苷再孵育48 h，滴加10 μL CCK8溶液，將細(xì)胞與含90 μL培養(yǎng)基、10 μL CCK-8、100 μL CCK-8的混合物在37 ℃下培養(yǎng)2 h，在450 nm波長處測定吸光度，確定細(xì)胞活力。

2.3 RT-qPCR檢測 用OGD處理神經(jīng)元細(xì)胞后，加入不同濃度(0、2.5、5、10、25、50 μmol/L)葒草苷，3 d后使用TRIzol試劑從神經(jīng)元細(xì)胞中提取總RNA以合成cDNA。對樣品中Nefh、Gap43 mRNA表達(dá)進(jìn)行分析，引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.4 Western Blot檢測 分別向空白對照組、OGD組、OGD+葒草苷組神經(jīng)元細(xì)胞中加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，BCA試劑盒定量總蛋白，SDS-PAGE法分離出蛋白樣品(40 μg)并轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜，加入anti-GAP43(1∶1 000)、anti-Ace-tubulin(1∶1 000)、anti-Tyr-tubulin(1∶500)、anti-GAPDH(1∶10 000)，在室溫下與相應(yīng)二抗孵育1 h。條帶可視化由ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)完成，并通過Image Lab3.0軟件分析定量。

2.5 脊髓損傷大鼠模型建立及葒草苷給藥 將36只成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、脊髓損傷組、脊髓損傷+葒草苷給藥組，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模。腹腔注射8%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后備皮消毒，沿脊中線切開，通過椎板切除術(shù)暴露脊髓于T9椎體水平，暴露的脊髓用動脈夾(30 g)夾閉脊髓1 min；假手術(shù)組僅暴露脊髓而不夾閉。術(shù)后護(hù)理包括每天2次輔助排尿至膀胱功能恢復(fù)，并使用頭孢唑林鈉(50 μg/kg，腹腔注射)預(yù)防感染，同時(shí)在每天固定時(shí)段通過腹腔注射對脊髓損傷+葒草苷給藥組大鼠給予葒草苷(25 mg/kg)，持續(xù)28 d。所有外科手術(shù)和術(shù)后動物護(hù)理均經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，操作均符合《實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理和使用指南》。

2.6 免疫熒光染色 4%多聚甲醛分別固定空白對照組、OGD組、OGD+葒草苷組神經(jīng)元細(xì)胞20 min后，PBS清洗3次，每次5 min。從飼養(yǎng)28 d的脊髓損傷組以及脊髓損傷+葒草苷給藥組的大鼠中分離得到脊髓組織(損傷中心兩側(cè)各保留1 cm)，在4%多聚甲醛中固定24 h，乙醇脫水后石蠟包埋切片(厚度5 μm)，在37 ℃下用5% BSA封閉液封閉細(xì)胞及切片30 min，在4 ℃下與一抗孵育過夜，加入anti-Tuj-1(1∶1 000)、anti-Ace-tubulin(1∶1 000)、anti-Tyr-tubulin(1∶500)、anti-GFAP(1∶500)，孵育后以PBST漂洗3次, 在37 ℃下與相應(yīng)二抗孵育60 min，繼續(xù)用PBST洗滌，與DAPI溫育后封片。所有圖像均用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行捕獲，通過Image J圖像分析軟件對神經(jīng)元軸突長度進(jìn)行定量分析，測量每個(gè)神經(jīng)元最長的神經(jīng)突，每個(gè)圖像平均選擇10個(gè)代表性神經(jīng)元，每個(gè)條件選擇4個(gè)代表性圖像。

2.7 行為學(xué)評價(jià) 為了評價(jià)脊髓損傷后的恢復(fù)特征，由2名對實(shí)驗(yàn)條件不知情、訓(xùn)練有素的研究人員進(jìn)行行為學(xué)評價(jià)。Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)量表評分和斜板實(shí)驗(yàn)評分選擇在造模后的第0、1、7、14、28天進(jìn)行，其中前者是將大鼠置于空曠場地，2名觀察者根據(jù)其肢體和關(guān)節(jié)運(yùn)動、肢體協(xié)調(diào)性、穩(wěn)定性、尾巴位置、腹部位置的組合給出0～21分的評分；后者是將大鼠放在1塊覆蓋有橡膠墊的光滑木板上，斜板可繞其底部旋轉(zhuǎn)，體軸平行于板的垂直軸，之后逐漸增大斜板與水平面間夾角，當(dāng)大鼠恰好在斜板上停留5 s時(shí)記錄角度。每只大鼠重復(fù)5次。

3 結(jié)果

3.1 葒草苷對原代神經(jīng)元的細(xì)胞毒性作用 葒草苷分子結(jié)構(gòu)見圖1A，本實(shí)驗(yàn)在原代神經(jīng)元中加入不同濃度(0、2.5、5、10、25、50 μmol/L)該成分并孵育48 h，結(jié)果見圖1B。由此可知，各組吸光度均無顯著差異(P>0.05)，提示葒草苷在0～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)對原代神經(jīng)元無細(xì)胞毒性作用。

圖1 葒草苷對原代神經(jīng)元的細(xì)胞毒性

3.2 葒草苷促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生 本實(shí)驗(yàn)將不同濃度(0、2.5、5、10、25、50 μmol/L)葒草苷與OGD處理神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并以神經(jīng)元軸突再生過程的關(guān)鍵蛋白——重肽神經(jīng)絲蛋白(NEFH)、生長相關(guān)蛋白-43(GAP43)作為檢測指標(biāo)，結(jié)果見圖2。由此可知，在3 d時(shí)葒草苷以劑量依賴性的方式使Nefh、Gap43 mRNA表達(dá)增加(P<0.05，P<0.01)，在25、50 μmol/L劑量下相較于對照組(0 μmol/L)差異明顯(P<0.01)，由于在50 μmol/L劑量下Nefh、Gap43 mRNA表達(dá)增加最高，故選擇其進(jìn)行后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)(圖2A～2B)；與OGD組比較，OGD+葒草苷組神經(jīng)元細(xì)胞GAP43蛋白表達(dá)增加(P<0.05)(圖2C～2D)；Tuj-1免疫熒光染色顯示，OGD+葒草苷組神經(jīng)元軸突長度為(103.2±13.45) μm，而OGD組僅為(49.00±10.03) μm(圖2E～2F)，提示葒草苷能以劑量依賴性的方式促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生。

注：與OGD組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 葒草苷調(diào)節(jié)原代神經(jīng)元細(xì)胞微管穩(wěn)定 本實(shí)驗(yàn)以乙酰化微管蛋白(Ace-tubulin)、酪氨酸化微管蛋白(Tyr-tubulin)為指標(biāo)，通過Western blot檢測其表達(dá)，結(jié)果見圖3。由此可知，相較于OGD組，OGD+葒草苷組上調(diào)了乙酰化微管蛋白表達(dá)(P<0.05)，降低了酪氨酸化微管蛋白表達(dá)(P<0.05)(圖3A～3C)；免疫熒光染色(圖3D～3F)顯示，葒草苷增強(qiáng)了乙酰化微管蛋白熒光強(qiáng)度，降低了酪氨酸化微管蛋白熒光強(qiáng)度，使A/T比增加(P<0.01)，表明葒草苷可調(diào)節(jié)原代神經(jīng)元細(xì)胞微管穩(wěn)定性。

注：與OGD組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 葒草苷調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定，促進(jìn)軸突再生 本實(shí)驗(yàn)對脊髓組織切片進(jìn)行免疫熒光染色，以GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，Ace-tubulin標(biāo)記軸突，結(jié)果見圖4。由此可知，脊髓損傷后GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞在病灶邊緣積聚，而葒草苷增加了Ace-tubulin(+)面積，促進(jìn)了軸突生長穿過病灶邊界并延伸至遠(yuǎn)端區(qū)域，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

注：與脊髓損傷組比較，**P<0.01。

3.5 葒草苷促進(jìn)脊髓損傷大鼠功能恢復(fù) 本實(shí)驗(yàn)建立脊髓損傷大鼠模型后連續(xù)給藥28 d，分別于造模后0、3、7、14、28 d進(jìn)行BBB量表評分及斜板實(shí)驗(yàn)評分，結(jié)果見圖5。由此可知，造模后第0天除假手術(shù)組外，其他2組大鼠BBB量表評分為0，表示造模成功；第14天脊髓損傷+葒草苷給藥組的BBB量表評分為8.000分，脊髓損傷組評分為5.333分；第28天時(shí)2組評分分別為10.17、7.000分；第14、28天時(shí)脊髓損傷+葒草苷給藥組斜板實(shí)驗(yàn)評分分別為34.17°、43.33°，高于脊髓損傷組的25.00°、30.83°(P<0.05，P<0.01)，提示葒草苷可促進(jìn)脊髓損傷后功能恢復(fù)。

注：與脊髓損傷組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的神經(jīng)再生是脊椎動物自我修復(fù)能力的最大限制之一，也是當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)研究中最令人困擾且無法治療的挑戰(zhàn)之一。目前臨床上尚無副作用小、療效好的治療藥物，而脊髓損傷所帶來的社會負(fù)擔(dān)不容忽視，因此，能夠有效促進(jìn)損傷脊髓結(jié)構(gòu)以及功能恢復(fù)的藥物是迫切需要的。

葒草苷作為一種提取自天然中草藥的黃酮類單體化合物，具有副反應(yīng)小、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道葒草苷在腦缺血/再灌注損傷中具有神經(jīng)保護(hù)作用[9]。同時(shí)，葒草苷能抑制過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[13]。Guo等[14]亦報(bào)道過，葒草苷作為一種神經(jīng)保護(hù)劑，在脊神經(jīng)結(jié)扎模型中可用于神經(jīng)性疼痛的治療。研究證明，多種黃酮類化合物能夠調(diào)節(jié)軸突再生：如English等[15]發(fā)現(xiàn)7,8-二羥基黃酮作為原肌球蛋白受體激酶B的小分子激動劑，能促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的軸突再生；Wang等[16]證明了槲皮素可以促進(jìn)急性脊髓損傷后的軸突再生。基于上述，本實(shí)驗(yàn)猜測葒草苷可能作用于脊髓損傷。

盡管改善脊髓損傷恢復(fù)涉及各種各樣的因素，但促進(jìn)軸突再生被認(rèn)為最有潛力，也是最有可能逆轉(zhuǎn)癱瘓的因素[17]。有研究表明通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)在信號、調(diào)節(jié)神經(jīng)元外部微環(huán)境、生物支架植入等方法促進(jìn)軸突生長以改善脊髓損傷后功能的恢復(fù)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)葒草苷可以顯著增加Nefh、GAP43等軸突再生過程中關(guān)鍵蛋白的mRNA和(或)蛋白表達(dá)，同時(shí)通過Tuj-1免疫熒光染色直觀地反映了葒草苷處理可以增加氧糖剝奪神經(jīng)元的軸突長度，提示其能夠促進(jìn)軸突再生。

微管是細(xì)胞骨架的關(guān)鍵組分，在正常神經(jīng)元中，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，平行排列并聚集成束，并延伸至軸突末端參與組成生長錐，進(jìn)而參與軸突生長[5]。多項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元在損傷后無法重建功能性生長錐[19-21]；然而外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元可以再生出功能性的活動末梢[22]。兩者的主要差異在于損傷部位的細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu)：小鼠坐骨神經(jīng)損傷后，生長錐的大小仍恒定，微管保持了典型的束狀結(jié)構(gòu)；而脊髓損傷后，微管的穩(wěn)定性被打破，其排列變得雜亂無章且在細(xì)胞內(nèi)分布不均，生長錐轉(zhuǎn)化為腫脹的、無生長能力的回縮泡結(jié)構(gòu)[23]。微管穩(wěn)定除了上文所述的具有調(diào)節(jié)軸突尖端由回縮泡結(jié)構(gòu)向生長錐轉(zhuǎn)變的作用外，其對于調(diào)節(jié)損傷軸突再生的啟動至少還包括以下兩方面：一是神經(jīng)元的極化受微管穩(wěn)定性狀態(tài)的調(diào)控[24]；二是微管穩(wěn)定在軸突再生所需細(xì)胞器(例如線粒體)、蛋白質(zhì)(例如肌動蛋白)等的定向運(yùn)輸過程中起重要作用[25]。Ertürk等[22]報(bào)道使用微管解聚藥物諾考達(dá)唑處理背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元后，可將微管分散，軸突尖端轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)損傷后的回縮泡結(jié)構(gòu)。相反，通過埃坡霉素B、紫杉醇等藥理性微管穩(wěn)定作用，可增強(qiáng)軸突尖端處的微管聚合，以促進(jìn)神經(jīng)元的極化與再生[7, 26]。因此，恢復(fù)微管的穩(wěn)定性是促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生與功能恢復(fù)的重要途徑。在原代神經(jīng)元細(xì)胞中，本研究通過Western blot及免疫熒光等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)葒草苷可以上調(diào)乙酰化微管蛋白的表達(dá)，同時(shí)降低酪氨酸化微管蛋白的表達(dá)，增加A/T比值，提高微管的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)軸突再生。脊髓組織切片的免疫熒光實(shí)驗(yàn)亦支持了上述結(jié)果。同時(shí)，與埃坡霉素B、紫杉醇等抗腫瘤藥物比較，葒草苷作為天然中草藥提取物，其副反應(yīng)小且價(jià)格較低，具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

最后利用急性脊髓損傷傷動物模型，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評估了葒草苷在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)能否發(fā)揮作用，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，進(jìn)行葒草苷給藥的大鼠BBB評分及斜板評分均增加，表明葒草苷可改善脊髓損傷大鼠運(yùn)動功能。

總而言之，本研究表明葒草苷通過穩(wěn)定微管以促進(jìn)軸突再生，最終改善脊髓損傷后大鼠運(yùn)動功能，這為治療脊髓損傷提供了新的策略，也為天然中草藥在脊髓損傷治療中的應(yīng)用提供了一定參考。但葒草苷如何增加微管穩(wěn)定性或是否存在其他機(jī)制促進(jìn)軸突再生，仍需進(jìn)一步研究。