美沙西汀-甲氧基-13C及其類似物的合成

陳 凱，代德勝，王春玲，魏翠雯，卿 晶，沈桂富

(深圳市中核海得威生物科技有限公司，廣東 深圳 518057)

呼氣試驗是指呼氣成分直接測定或測定攝入特定化合物后呼氣中的標志氣體，實現對機體生理、病理狀態的非侵入性判斷。呼氣試驗技術簡單、方便，受檢者依從性好、容易操作，可完成一般方法難以進行的診斷[1]。目前已經應用的臨床技術包括一氧化氮呼氣檢測哮喘[2]、13/14C-尿素呼氣試驗診斷幽門螺桿菌感染[3]、呼氣試驗測定紅細胞壽命、13C-螺旋藻診斷胃排空功能障礙[4]等。其中13/14C-尿素呼氣試驗已經成為幽門螺桿菌感染診斷應用最廣泛的方案，產業規模在中國已超過20億每年。

肝臟是人體最重要的代謝器官之一，擔負著解毒、營養物質代謝、蛋白質合成、膽汁分泌等重要的生化功能，肝臟功能的準確性測定有重要的臨床意義。目前常用的檢測方法包括血液生化檢查、藥物動力學實驗和代謝實驗檢測等。鑒于13/14C-尿素呼氣試驗診斷幽門螺桿菌準確度高、市場推廣好，13C-標記化合物呼氣試驗檢測肝部功能成為一個新的研究熱點。例如：13C-氨基比林[5]、L-[1-13C]-苯丙氨酸[6]、咖啡因[3-甲基-13C][7]、美沙西汀-甲氧基-13C[8-9]、D-半乳糖-1-13C[10]等，其中美沙西汀-甲氧基-13C較其他的標記化合物具有用量小、幾乎無毒、代謝快、適用性廣等優點，是研究最活躍的肝功能呼氣試驗底物[11-12]。

鑒于美沙西汀-甲氧基-13C呼氣試驗的特點，近些年關于美沙西汀-甲氧基-13C評估肝功能、診斷肝硬化和肝移植患者術前與術后的功能評價[13]等方面的呼氣診斷臨床研究很多，多項實驗處于臨床Ⅱ期和臨床Ⅲ期。目前一般以碘甲烷-13C為標記原料，收率高，是一種常用的合成方法。由于碘甲烷-13C毒性大，運輸、儲存管理要求非常嚴格，且每摩爾碘甲烷-13C的價格遠高于甲醇-13C，通過甲醇-13C合成美沙西汀-甲氧基-13C得到更多關注[14-15]。

對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C是美沙西汀-甲氧基-13C的類似物，可作為藥物、防腐劑以及香料等穩定同位素內標試劑的重要中間體。對甲氧基苯甲酸常見的合成方法以硫酸二甲酯為甲基化試劑，該合成方案無法直接應用于對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的合成。2018年，上海穩定同位素工程技術研究中心的王偉[16]以尼鉑金乙酯、碘甲烷-13C為原料，通過酚羥基甲基化、水解乙酯兩步反應得到對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C，其中碘甲烷-13C的利用率為79.32%。

本文以Mitsunobu反應作為關鍵反應，配合簡單的官能團轉化，以甲醇-13C為標記試劑，合成美沙西汀-甲氧基-13C和對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C，擬為呼氣檢測肝功能研究的開展提供參考。

1 主要實驗材料

1.1 主要試劑

氧羰酰-4-羥基苯胺(純度>98%)、三苯基膦(純度>98%)、偶氮二甲酸二乙酯(純度>98%)、偶氮二甲酸二異丙酯(純度>98%)、三氟乙酸(純度>99%)、三乙胺(純度>99.5%)、乙酰氯(純度>98%)：薩恩化學技術(上海)有限公司；尼泊金甲酯(純度>98%)：上海邁瑞爾化學技術有限公司；甲醇-13C(純度>98%，同位素豐度為99%13C)、美沙西汀-甲氧基-13C(純度98.7%，同位素豐度為99%13C，對照品)：劍橋同位素實驗室；對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C(純度98%，同位素豐度為99%13C，對照品)：武漢紐瑞德特種氣體有限公司；乙腈(色譜純)：默克股份兩合公司；乙酸乙酯(EA，分析純)、正己烷(HEX，分析純)、乙醇(分析純)、碳酸鈉(分析純)、氯化鈉(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；柱層析硅膠：精制型，200～300目，青島海洋化工有限公司；除特別說明外，所有試劑均直接使用。

1.2 主要儀器

XPE303S型電子天平：梅特勒-托利多；MS7-H550-Pro數顯加熱磁力攪拌器恒溫磁力攪拌器：大龍興創實驗儀器(北京)股份公司；EYELA東京理化旋轉蒸發儀 N-1300系列：東京理化器械株式會社；SHK-Ⅲ循環水式多用真空泵：鄭州科泰實驗設備有限公司；HB-20耐腐蝕隔膜真空泵：上海滬析實業有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；核磁共振氫譜(布魯克400M核磁AVANCE-Ⅲ)檢測和高分辨質譜(賽默飛高分辨質譜Q Exactive Focus)檢測由北京大學深圳研究生院化學生物學和生物技術學院協助完成。

2 實驗方法

2.1 反應機理

Mitsunobu 反應[17]是一種涉及醇羥基活化的親核取代反應，其反應機理示于圖1。醇在偶氮二甲酸二乙酯和三苯基膦的作用下形成活性中間體，該活性中間體被親核試劑進攻之后碳氧鍵會發生斷裂。依據上述反應原理，甲醇-13C的碳氧鍵可以被偶氮二甲酸二乙酯、三苯基膦活化，之后酚羥基進攻活化中間體即可完成美沙西汀-甲氧基-13C中醚鍵的構建。

2.2 路線優化

本研究采用對乙酰氨基酚、甲醇-13C為原料，通過Mitsunobu反應得到美沙西汀-甲氧基-13C(圖2)。由于美沙西汀-甲氧基-13C與反應的副產物三苯基氧化膦極性接近，分離困難，不適于進行放大研究。通過優化，將反應原料對乙酰氨基酚更換為極性更小的氧羰酰-4-羥基苯胺。

以氧羰酰-4-羥基苯胺、甲醇-13C為起始原料，首先通過Mitsunobu反應得到化合物3，由于化合物3極性小，很容易與副產物三苯基氧化膦分離。

2.3 美沙西汀-甲氧基-13C合成

美沙西汀-甲氧基-13C的合成路線示于圖2。將100 mL乙腈加至250 mL圓底燒瓶中，再依次加入4.18 g氧羰酰-4-羥基苯胺、0.81 mL甲醇-13C和6.28 g三苯基膦，冷卻至0 ℃。將4.40 mL偶氮二甲酸二異丙酯緩慢加入反應體系，隨后在室溫條件下攪拌4 h。體系用30 mL飽和碳酸鈉水溶液淬滅，用200 mL乙酸乙酯萃取2次，合并有機相。有機相使用30 mL飽和食鹽水清洗，無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓濃縮。剩余物用柱層析色譜(200～300目，洗脫劑為乙酸乙酯∶正己烷=1∶4)純化，真空干燥后得到白色固體3.12 g。將白色固體溶于60 mL二氯甲烷中，冷卻至0 ℃，向反應體系中加入10 mL三氟乙酸。室溫攪拌3 h，減壓蒸餾除去體系中的溶劑和三氟乙酸。隨后將濃縮物溶于80 mL二氯甲烷中，冷卻至0 ℃，向反應體系中依次加入4.16 mL三乙胺、1.78 mL乙酰氯，室溫反應2 h。使用10 mL飽和氯化銨淬滅反應；反應液用乙酸乙酯100 mL萃取3次，合并有機相，用飽和食鹽水20 mL洗滌，無水硫酸鈉干燥；過濾、旋干溶劑后用乙醇重結晶，得到固體2.10 g，即為美沙西汀-甲氧基-13C。

圖2 美沙西汀-甲氧基-13C的合成路線Fig.2 Synthetic route of of methacetin-methoxy-13C

2.4 對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C合成

對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C合成路線示于圖3。將100 mL乙腈加至250 mL圓底燒瓶中，再依次加入3.04 g尼泊金甲酯、0.81 mL甲醇-13C和6.28 g三苯基膦，冷卻至0 ℃。將4.40 mL偶氮二甲酸二異丙酯緩慢加入反應體系，隨后在室溫條件下攪拌4 h。體系用30 mL飽和碳酸鈉水溶液淬滅，用200 mL乙酸乙酯萃取2次，合并有機相。有機相使用30 mL飽和食鹽水清洗，無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓濃縮。剩余物用柱層析色譜(200～300目，洗脫劑為乙酸乙酯∶正己烷=1∶8)純化，真空干燥后得到白色固體2.65 g。白色固體溶于80 mL乙腈/水中，冷卻至0 ℃，加入1.60 g氫氧化鈉。室溫反應12 h，冷卻至0 ℃，使用6 mol/L的鹽酸酸化至體系pH為1。使用200 mL乙酸乙酯萃取反應液3次，有機相使用30 mL飽和食鹽水清洗，無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓濃縮。濃縮后的固體用80 ℃的乙醇溶解，冷卻至2～8 ℃結晶。過濾干燥后得到產品2.26 g，即為對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C。

圖3 對甲氧基苯甲酸-13C的合成路線Fig.3 Synthetic route of 4-methoxybenzoic acid-methoxy-13C

3 結果與討論

3.1 條件優化

溶劑和活化試劑對反應產率的影響結果列于表1，由表1可以看出，乙腈作為反應溶劑時收率高于用四氫呋喃和二氯甲烷，偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD)的反應效果好于偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)。表1中各實例中反應液濃度均為0.25 mmol/mL，反應時間均為4 h。使用三氟乙酸脫除叔丁氧羰基，最后在堿性條件下對氨基乙酰化即可得到美沙西汀-甲氧基-13C。該合成方案可放大，操作簡單，可作為合成美沙西汀-甲氧基-13C工藝化的方案。

表1 Mitsunobu反應條件優化Table 1 Optimization of Mitsunobu reaction conditions

在美沙西汀-甲氧基-13C合成研究的基礎上，以尼泊金甲酯、甲醇-13C為原料，通過Mitsunobu反應、水解甲酯兩步反應得到對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C。相比以碘甲烷-13C作為標記原料的合成方法，本方法降低了成本。

3.2 美沙西汀-甲氧基-13C的結構表征和含量測定

美沙西汀-甲氧基-13C合成樣品的核磁共振氫譜示于圖4。1H NMR(400 MHz, Acetone-d6)δ9.02(s,1H),7.60-7.45(m,2H),6.92-6.75(m,2H),3.92(s,2H),3.56(s,2H),2.03(s,3H)。美沙西汀-甲氧基-13C的高分辨質譜數據為ESI-MS:[M+H]+=167.089 6，[M+Na]+=189.071 6，結構表征數據與對照品一致。

圖4 美沙西汀-甲氧基-13C的核磁共振氫譜Fig.4 1H NMR of methacetin-methoxy-13C

在合成樣品純度測定方面，本文以純度為98.7%的美沙西汀-甲氧基-13C樣品作為對照品。通過分析對照品和合成樣品的高效液相數據(表2)，根據外標法計算出合成樣品的純度為99.3%。經高分辨質譜檢測美沙西汀-甲氧基-13C合成樣品的同位素豐度為99.2%13C，符合標記化合物豐度和純度的要求。

表2 美沙西汀-甲氧基-13C的高效液相色譜分析Table 2 HPLC data of methacetin-methoxy-13C

3.3 對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的結構表征和含量測定

對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C合成樣品的核磁共振氫譜示于圖5。1H NMR(400 MHz, Acetone-d6)δ8.04-7.92(m, 2H),7.07-6.92(m,2H),4.06(s,1.5H),3.70(s,1.5H)。美沙西汀-甲氧基-13C的高分辨質譜數據為ESI-MS:[M-H]+=152.042 2(負離子質譜)，結構表征數據與對照品一致。

圖5 對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的核磁共振氫譜Fig.5 1H NMR of 4-methoxybenzoic acid-methoxy-13C

在產物純度測定方面，本文以純度為98%的對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C樣品作為對照品。通過對照品和合成樣品的高效液相色譜分析(表3)，根據外標法計算出對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C合成樣品的純度為101.0%，符合純度要求。

表3 對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的高效液相色譜分析Table 3 HPLC data of 4-methoxybenzoic acid-methoxy-13C

4 結論

本研究通過Mitsunobu反應、官能團轉化合成了美沙西汀-甲氧基-13C及其類似物對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C。美沙西汀-甲氧基-13C合成樣品的純度為99.2%，同位素豐度為99.2%13C，以甲醇-13C計算收率為63%。對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C合成樣品的純度為101.0%，同位素豐度為99.2%13C，以甲醇-13C計算收率為67%。美沙西汀-甲氧基-13C和對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的同位素豐度相對于標記原料甲醇-13C未發生明顯降低。美沙西汀-甲氧基-13C的合成為進一步的呼氣試驗研究提供了基礎，同時該方法還可應用于其他芳基醚類標記化合物如非那西汀-乙氧基-1-13C等。