HIV抗體自備質控品穩定性分析

張應宣，徐 潔，岑榮芳

(都勻市疾病預防控制中心，貴州 都勻 558000)

在艾滋病抗體初篩檢測實驗過程中，設置外部HIV陽性血清質控品，是實驗活動中十分重要的一個環節,反映室內環境、設備、加樣及人員等情況是否處于穩定、連續、可靠、準確狀態。室內質量控制穩定與否，是試驗結果好與差的判定和鑒別前提條件[1]。根據《全國艾滋病檢測技術規范》(2020版)的要求，建立與艾滋病抗體檢測實驗室相適應的室內質量控制體系，能更好地開展艾滋病抗體初篩實驗室檢測，保證檢測結果及數據的穩定性和準確性，從源頭上把好質量關[2]。本室對自備外部質控品進行室內質控，獲得的20組數據，即質控品吸光度(OD)值和離散度(S/CO)值，采用“即刻”法和Levey-Jennings質控圖相進行室內質控分析。制備好的外部質控品每次試驗使用1支，每支0.5 ml，在第一周單獨測一次，第二周單獨測一次，至第三周起質控品和樣本在相同條件下進行試驗，以此類推，獲得20次及以上的質控品實驗數據來進行質控分析，以期了解本單位艾滋病抗體初篩室的室內質量控制活動是否符合實驗要求[3]。

1 材料和方法

1.1 材料 艾滋病抗體檢測試劑盒(規格：96/T,麗珠)，可調式移液器(規格：10～100 μl)，多功能酶標儀(規格：MB-580，深圳匯松)，外部質控品(規格：0.5 ml/支)，恒溫水浴箱、自動洗板機、加樣槍頭等。

1.2 方法

1.2.1 試驗原理 采用雙抗原夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，在微孔條上預包被高純度重組HIV(1+2型)抗原，加入50 μl樣本后震蕩混勻，置于(37±0.5)℃水浴箱孵育1 h，洗板；加入酶標記抗原，震蕩混勻再孵育1 h，洗板；加入顯色劑，震蕩混勻，孵育30 min，滴加終止液，混勻，根據顯色深淺酶標儀讀取光密度OD值及S/CO值。

1.2.2 計算與繪圖分析 外部質控品實驗數據(OD值及S/CO值)20次以內及以上檢測記錄結果，用“即刻”法和L-J質控圖聯合軟件進行自動計算和繪圖分析。

2 結果

2.1 外部質控品選擇 將血清稀釋系列濃度比為：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024；測得OD值：2.608,3.300，3.300，3.123，2.616，1.882，1.142，0.643，0.360，0.147。質控品選擇：依據試劑盒要求，選擇0.230為臨界值，則0.230×2=0.460，0.230×3=0.690。質控品的選擇以1∶256，OD值0.643,符合2～3倍臨界值(CUTT OFF，CO)范圍，因此選擇1∶256稀釋度血清作為質控品，并分裝，0.5 ml/支，分成若干支，-20℃保存備用。

表1 自備質控品HIV抗體“即刻”法質控自動判斷表

圖1 L-J質控圖分析判斷圖

3 討論

實驗室制備HIV質控品，根據抗原抗體等價結合的原則，將已確認過的HIV陽性血清以3 000 r/min離心5～10 min，置56℃水浴滅活30 min，靜置冷卻。將已滅活的HIV陰性血清對HIV陽性血清進行倍比稀釋至若干稀釋比，稀釋后的血清由低至高的順序編號，分別為1、2、3……10。將所有稀釋后的血清按樣本進行試驗，選取接近2～3倍臨界值(CUTT OFF值，CO值)的血清樣本作為外部質控品。由于質控品在分裝保存后效價會出現一定程度下降，因此，根據實驗要求選擇接近2～3倍CUTT OFF值。本室通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)獲得稀釋比為1∶256，OD值0.643血清樣本符合外部質控品的要求。把1∶125的血清進行分裝保存一周血清穩定下來，再進行質控試驗，這是室內質控獲得成功與穩定的關節環節。

試劑廠家在包被微孔條時已經固定好一定含量的HIV抗原，當外部質控品抗體過多時，會出現前帶現象，而抗體過少時會出現后帶現象；只有在抗原抗體在等價時，試驗效應才是最佳結合，出現等價帶效應現象，是試驗預期的期望值[4]。

“即刻”法質控數據，須按實驗時間順序錄入數據，不能按數據大小排列錄入，這會影響整個過程的穩定性和重復性，不符合正態分布。表1結果按此法先后錄入實驗數據，自動判斷結果顯示為沒有出現警告、失控現象。變異系數(CV)7.67%小于10%，說明自制質控品穩定性好，檢測結果變異性符合質量控制要求。然而，“即刻”法質控只是解決實驗數據結果是否失控，不能體現實驗環境條件是否發生了變化，因此，需要繪制L-J氏質控圖才能反映實驗環境是否發生變化[5]。

L-J質控圖是反映時間-空間發生變化時實驗結果的變化，既能反映結果是否在控，又能體現實驗條件的穩定性[6]。從表2可以直觀地看出，實驗測得離散度(s/CO)值隨著時空變化沒有超出2倍標準差(±2 s)范圍，基本上呈現正弦式分布，實驗結果穩定在控。在第7～9次和第15～17次出現2次小的位移現象，s/CO值落在均值的一側(3次)，這種現象稱作漂移，提示實驗環境發生了變化，但沒有出現5～7次趨勢現象，結果可接受。

綜合表1和圖1分析來看，“即刻”法和L-J質控圖表明：自備質控品具備穩定性、連續性、可靠性，適合HIV抗體篩查室內質控活動。

如果自備的質控品在實驗中若出現以下情況之一，應暫停試驗，查找原因：(1)出現1次超出3倍標準差(±3 s)范圍的變化；(2)連續2次出現同一方向超(±2 s)圍的變化；(3)連續4次出現同一方向超出1倍標準差(±1 s)范圍的變化；(4)連續10次結果都在(±1 s)范圍內，但落在均值線的同一側。

出現漂移現象可能原因及糾正：(1)洗板次數，保持所有實驗同樣洗板次數；(2)酶標儀和移液器，定期校準或檢定，上機前，應開機30 min，保證酶標儀照射光強度穩定；(3)環境溫濕度變化及空調風口朝向，應控制溫濕度環境，空調開口不要對著實驗平臺，造成室內相對溫濕度不平衡。

質控圖若出現趨勢現象，則可能是由參數的緩慢改變引起，引起的可能因素及糾正：(1)檢測試劑，更換試劑時應做平行試驗；(2)質控品，質控品從-20℃冰柜拿出解凍后應放置在2～8℃，一周內用完，用不完則丟棄，不應反復凍融，以免效價降低；(3)試劑、樣本、質控品，應放置室溫平衡30 min；(4)反應時間，嚴格按照試劑盒說明書在水浴避光孵育1 h，不應人為減少反應時間；(5)讀取結果，應在加終止液后10 min內讀取結果，以免形成結晶，改變光的折射，降低OD值計算讀數；(6)加樣，槍頭應浸入液面2～3 mm,反向加樣，保證加樣量足夠。

在實驗活動過程中，要制定每一年度的室內質控計劃并定期分析，應用兩種質控分析，評判我們的實驗環境、人員、試劑、加樣過程是否穩定，結果是否可靠，實驗的重復性和連續性是否得到保證。嚴格按照實驗室SOP文件開展實驗，并積極參加省級以上組織的室間PT能力驗證活動，以評價中心的實驗檢測能力(IQA)，保障實驗室檢測能力更上一層臺階[7]。在室內質控分析應用中，本中心同時作出兩種分析，既直觀又方便分析，獲得較佳的效果。