HPLC法同時測定蟾靈膏中華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈成分的含量

柏永淞，魯 杰，陳 庚，葉定勛，杜典河，熊意陵，謝 丹，阮婧華

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001)

蟾靈膏是國醫大師劉尚義教授的臨床常用膏方，是貴州中醫藥大學第一附屬醫院的特色膏方，該方在葛根散的基礎上加用了蟾皮、威靈仙等中藥，具有養陰活血，散結化癥的功效[1]。蟾皮為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮。蟾皮性涼、味辛，有微毒性，有較強的藥理活性，具有止毒消腫，止痛、開竅醒神、抗腫瘤等作用，在臨床的應用較為廣泛[2]。蟾皮作為蟾靈膏中的君藥，其化學成分復雜，主要有蟾蜍甾二烯類、吲哚堿類、甾醇類化合物[2]。其中蟾蜍甾二烯類是蟾皮的主要化學成分，主要包括酯蟾毒配基、蟾毒靈、華蟾毒精等化合物，此類成分具有升高血壓、使呼吸興奮的作用，還可治療原發性肝癌、肺癌、腸癌[3-4]。本文旨對蟾靈膏中的三種有效成分華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈采用HPLC法進行含量測定，為蟾靈膏的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ)。甲醇(分析純)乙腈(色譜純)乙酸(色譜純)。對照品：華蟾毒精(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq20041609，純度：HPLC≥98%)，酯蟾毒配基(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq20062403，純度：HPLC≥98%)，蟾毒靈(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq20061908，純度：HPLC≥98%)。樣品：蟾靈膏(批號：20200610、20200710、20200810)由貴州中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心制備。

2 方法與結果

2.1 標準對照品的制備 精密稱取經60℃干燥24 h后的對照品華蟾毒精1.015 mg、酯蟾毒配基1.002 mg、蟾毒靈0.998 mg，用甲醇溶解并定容至2 ml容量瓶中，過0.45 μm微孔濾膜得標準對照液。

2.2 樣品液的制備 稱取三批次蟾靈膏20 g置100 ml具塞錐形瓶中，加入50 ml甲醇80℃回流提取1 h，過濾，濾液揮干，加入60 ml水飽和正丁醇萃取三次，每次20 ml，合并正丁醇層，將正丁醇層水浴揮干，加入甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，過0.45 μm微孔濾膜即得樣品液。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 Eclipse XDB-C18(5 μm 4.6×250 mm)色譜柱，流動相為乙腈(A)-0.3%乙酸溶液(B)(46∶54)等度洗脫(0～20 min 46%A)，柱溫為30℃，流速為1 ml/min，進樣量為10 μl，檢測波長為296 nm。

2.3.2 線性關系考察 分別取“2.1”項定容后的對照品，分別將華蟾毒精、酯蟾毒配基、蟾毒靈用甲醇稀釋到不同濃度。按“2.3.1”項色譜條件進行分析處理，以對照品峰面積A對濃度C進行線性回歸，得回歸方程，見表1。

表1 華蟾毒精、酯蟾毒配基、蟾毒靈線性回歸方程

2.3.3 穩定性試驗 分別取“2.1”項定容后的對照品，按“2.3.1”項色譜條件進行分析處理，進樣量10 μl，于0、2、4、6、8、10、12 h進樣，12 h內按“2.3.1”項色譜條件進行分析處理，測得華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈峰面積積分值的RSD值分別為2.77%、2.59%、1.99%，表明穩定性良好。

取“2.2”項樣品，按“2.3.1”項色譜條件進行分析處理，進樣量10 μl，分別于0、2、4、8、16、32 h進行測定，測得三批樣品峰面積積分值的RSD值分別為2.87%、2.64%、2.07%，均小于3%，表明樣品32 h內穩定性良好。

2.3.4 精密度試驗 取“2.1”項樣品，按“2.3.1”項色譜條件進行分析處理，與1 d內連續進樣6次，計算精密度值，結果表明華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈精密度分別為1.92%、2.18%、1.88%，RSD值均小于3%，表明精密度良好。

2.3.5 重復性試驗 取同一份樣品6份，按“2.3.1”項色譜條件進行分析處理，結果表明華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈RSD值分別為1.76%、1.89%、1.64%，均小于3%，表明實驗重現性良好。

2.3.6 加樣回收試驗 精密稱取3批蟾靈膏5 g，并按“2.2”項下方法處理樣品得樣品液，分別加入華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈對照品0.03 mg，制成供試品溶液。將供試品溶液按“2.3.1”項色譜條件進行分析處理，進樣量10 μl，測得華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈平均回收率分別為99.90%、102.60%、99.90%。表明本方法測得華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈的準確性良好。

2.3.7 樣品含量測定 精密吸取“2.1”項對照品，將3批蟾靈膏按“2.2”項樣品處理方法處理得3批樣品液，按“2.3.1”項色譜條件進行分析處理，進樣量10 μl，結果見表2。

表2 蟾靈膏中3種成分測定(mg/g)

3 討論

3.1 液相色譜條件的選擇 參照《中國藥典》2020版第一部“蟾酥”含量測定項下色譜條件：以乙腈：0.3%乙酸溶液(46:54)為流動相，檢測波長為296 nm，結果3種成分對照峰能夠完全分離，理論塔板數n>4 000,因此采用本法等度洗脫。采集的混合對照品如圖所示，結果見圖1。

圖1 混合對照品HPLC圖

3.2 供試品提取方法的選擇 本次實驗對蟾靈膏中蟾蜍甾二烯類提取曾用過不同的提取溶劑：水、甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇。結合不同提取的提取方式：超聲提取、索氏回流提取。結果表明甲醇為溶劑提取效率最高，經過水飽和正丁醇萃取后提取效率更高。并且索氏回流提取法比超聲提取法提取效率高。

考察了不同索氏回流提取時間15、30、45、60 min，結果表明15 min時提取完全不夠，60 min提取效率最高，所以選擇提取60 min。采集的樣品如圖所示，結果見圖2。

圖2 蟾靈膏樣品HPLC圖

干蟾皮是中華大蟾蜍的干燥皮，其有效成分與蟾酥類似，但是對于治療癌癥方面蟾皮的療效由于蟾酥[5]，因此本院特色膏方——蟾靈膏以干蟾皮入藥，原因于此。干蟾皮中所含的華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈既是毒性成分又是有效成分，過量服用會對機體造成傷害，因此對其含量要把握準確，本實驗方法簡單、結果準確、重復性好、專屬性高，結果也較為理想。該實驗為蟾靈膏的質量控制提供參考。