喙莢云實石油醚提取物對小鼠急性毒性實驗研究

劉 鑫，黃 聰，潘佳艷，黃勇其

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550002)

豆科(Fabaceac)云實屬(CaesalpiniaL.)植物全世界有100余種，中國有17種，主要分布在我國南部地區(qū)，藥用種類有14種，其中3種為國家及地方藥品標準收載品種，其他11種為民間用藥[1-4]。黔產(chǎn)云實屬藥用植物有6種，在民族醫(yī)藥廣為應用，如：云實(C.deapetala)為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》(2003版)收載品種，同時也是貴州常用的苗族藥，以根或根皮入藥[5]。目前，云實屬藥用植物的化學成份研究發(fā)現(xiàn)云實、蘇木(C.sappan)莖中主要含有黃酮類、二萜及其內(nèi)酯類、香豆素、酰胺、胡羅卜苷、β-谷甾醇、氨基酸、聯(lián)苯衍生物等[6-10]。本課題前期對喙莢云實莖葉和根各極性部位進行了體外抗腫瘤活性研究，石油醚部位抗腫瘤活性最強，具有很高的成藥潛力。但是一般抗腫瘤成分通常都具有毒性，如果毒性過大，則制約了抗腫瘤成分的成藥性，因此本研究對黔產(chǎn)喙莢云實莖葉和根抗癌活性部位石油醚提取物急性毒性進行研究。

1 儀器與材料

1.1 受試藥材與試劑 喙莢云實在4～5月采自貴州省冊亨縣，采回的藥材經(jīng)貴陽中醫(yī)學院藥學系何順志教授準確鑒定為豆科云實屬蘇木喙莢云實(Caesalpiniaminax)。乙醇(EtOH)；石油醚(Pe)：AR分析純，沸點60～90℃，批號：20121019，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 實驗動物 昆明小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，動物合格證號[SCXU(渝)2007-0005]。

1.3 實驗儀器 電熱恒溫水浴鍋：HH·S21-4北京長安科學儀器廠；數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型；昆山市超聲儀器有限公司JA1003 型電子天平；BüCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-215瑞士步琪有限公司；循環(huán)水真空泵：SHZ-D(Ⅲ)鞏義市予華儀器責任有限公司；電子調(diào)溫電熱套：98-1-B 10 000 ml天津泰斯特儀器有限公司；真空干燥箱：DZ-2BCⅡ天津泰斯特儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 喙莢云實石油醚提取物的制備 將采集藥材洗凈后陰干，粉碎成粗粉。稱取1 000 g喙莢云實粗粉(加10倍量的蒸餾水，煎煮3次每次1 h，過濾、合并濾液，減壓濃縮至3 000 ml)，分成2份，各1 500 ml并轉(zhuǎn)入3 000 ml分液漏斗中進行萃取，基于相似相容的萃取原理，萃取所用的試劑極性不同，本實驗采用一般萃取規(guī)則由小極性到大極性依次萃取，從而可以將總提物中的各個極性部位分離出來。將已制備好的濾液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分液漏斗洗凈后用適量真空油脂涂抹在活塞處，以防止漏液，按1∶1的比例量取石油醚進行萃取；加入石油醚萃取時充分振搖，振搖3次后靜置待其分層，極性較小的一些脂溶性成分通過振搖后會充分溶于石油醚中，而水溶液及水溶液中的大極性物質(zhì)因為跟石油醚不相溶而產(chǎn)生分層，且位于下層，故而從分液漏斗下面放出水溶液，轉(zhuǎn)入燒杯中，備用；再從上面倒出石油醚萃取液，多次萃取直至石油醚萃取層至無色時合并石油醚萃取層，回收石油醚，將回收瓶中的萃取液轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，揮干，之后放入真空干燥箱內(nèi)真空干燥，密封袋保存于玻璃干燥器中標記備用。

1.4.2 預實驗方法 預實驗用昆明種18～22 g小鼠 36 只，隨機分為 6 組，每組 6 只，雌雄各半。腹腔注射(ip)給藥，測得 LD100=4 g/kg，LD0=1 g/kg。根據(jù)預實驗結果，初步摸索出小鼠的死亡劑量，根據(jù)預試驗結果，正式實驗注射藥物濃度，分為4組，各組劑量間比值為 0. 7 分別為4.00 g/kg、2.80 g/kg、1.96 g/kg、1.37 g/kg，生理鹽水稀釋。

1.4.3 喙莢云實石油醚提取物半數(shù)致死量(LD50)的測定 采用改進寇氏法。腹腔注射(ip)給藥。由4 g/kg開始按1∶0.7比例等比稀釋得一系列的濃度供試液。取小白鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，每組10只，各組分別以不同濃度供試液按20 ml/kg給藥容量一次性ip給藥，觀察14 d，逐日記錄各組小鼠死亡數(shù)和中毒反應。計算得喙莢云實石油醚提取物ip給藥LD50和95%可信限。

2 結果

2.1 小鼠中毒癥狀觀察 對照組小鼠生長及行為正常，體重增加。4組小鼠，大多狀態(tài)良好，行為活動正常，部分出現(xiàn)活動減少，四肢顫動，小便失禁，呼吸困難，翻正反射消失，隨后死亡。1、2、3 組則大多停止進食及飲水，一部分小鼠活動量明顯減少、身體蜷縮并不斷抖動、全身震顫等癥狀；一部分小鼠給藥后在籠內(nèi)上躥下跳，煩躁不安，啃咬鼠籠、精神亢奮、活動增加。

2.2 喙莢云實石油醚提取物毒性實驗結果 統(tǒng)計給藥后14 d內(nèi)各組動物死亡數(shù)，使用Bliss法計算喙莢云實石油醚提取物半數(shù)致死量。計算出喙莢云實石油醚提取物半數(shù)致死量LD50=1.961 g/kg；Feiller 法校正LD5095% 的可信限=1.650～2.330 g/kg；LD5=1.650 mg/kg，LD95=2.330 mg/kg。見表1。

表1 喙莢云實石油醚各組小白鼠用藥、死亡情況及計算(n=10，K=0.7)

2.3 小鼠各器官臟器重量 解剖各組小鼠，取臟器稱重。結果見表2。

表2 喙莢云實石油醚各組小白鼠臟器重量影響(n=10)

3 討論

貴州省擁有豐富的云實屬性植物資源，黔產(chǎn)云實屬藥用植物有 6 種，喙莢云實為其中之一，該植物資源豐富，其種子在民間用藥廣泛且療效顯著[5]。喙莢云實傳統(tǒng)用藥部位為種子，其具有良好的抗腫瘤作用，為探索喙莢云實的莖葉和根是否具有抗腫瘤作用，來擴大藥用資源范圍。本課題組對云實屬植物具有較扎實的研究基礎，已完成的國家自然科學基金項目(39560088)“從國產(chǎn)云實屬植物中篩選替代進口塔拉資源的研究”取得一定的研究成果。本課題組前期實驗結果表明，莖葉和根的石油醚部位有明顯的抑制腫瘤作用為其活性最強部位，其開發(fā)成抗腫瘤藥物的潛力較大。但通常抗腫瘤成分也有一定的毒性，因此在本研究中對喙莢云實莖葉和根石油醚提取物的急性毒性進行研究。

在前期實驗中發(fā)現(xiàn)喙莢云實石油醚提取物的口服生物利用度很低，腹腔注射給藥效果很好，因此在本研究中采用腹腔注射給藥。在實驗中最低劑量組的動物行為大部分正常，而在其他組別中均出現(xiàn)活動減少、抖動、精神亢奮等異常狀態(tài)。在小鼠解剖時發(fā)現(xiàn)，肝臟明顯腫大、淤血，其他臟器未見異常，由此可推測喙莢云實石油醚提取物的主要毒性在肝臟。半數(shù)致死量為LD50=301.75 mg/kg，LD5095% 的可信限=1.650～2.330 g/kg。本研究的結果對云實屬植物資源的合理利用和抗癌新藥的開發(fā)研究具有深遠的意義。