玉米須提取物對皮膚黑素瘤A375細胞遷移的影響及分子機制

吳敬英 黃進梅 李鳴九 古 東

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·論著·

玉米須提取物對皮膚黑素瘤A375細胞遷移的影響及分子機制

吳敬英1黃進梅2李鳴九3古 東1

目的： 明確玉米須提取物對皮膚黑素瘤遷移能力的影響。方法： 培養(yǎng)皮膚黑素瘤細胞系A(chǔ)375， 0.3、3、30 μg/mL的玉米須提取物處理A375細胞，劃痕法檢測A375細胞的遷移能力， 實時PCR檢測與遷移相關(guān)基因的表達。結(jié)果： 玉米須提取物組A375細胞遷移能力低于空白對照組，且濃度越高遷移力越弱；玉米須提取物組上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因TWIST1、SNAI1、SNAI2、VIM的表達量低于空白對照組， PTGS2基因表達量高于對照組。結(jié)論： 玉米須提取物能抑制黑素瘤A375細胞遷移能力，下調(diào)EMT相關(guān)基因表達。

玉米須提取物； 黑色素瘤； 遷移； EMT

玉米須(corn silk)是指在玉米成熟采集、已經(jīng)變褐并干枯了的雌花柱[1]。據(jù)報道，玉米須提取物對小鼠的肉瘤(S180)、肝癌(Hep)、胃癌(MFC)等腫瘤細胞均有抑制作用，能延長S180荷瘤小鼠的生存時間，增加荷瘤小鼠的免疫器官重量及吞噬功能，保護白細胞，促進T細胞轉(zhuǎn)化增殖[2]。本文研究玉米須提取物對黑素瘤A375細胞遷移能力的影響及分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米須提取物[3]玉米須干粉稱重后，用三氯甲烷抽提12 h，然后用沸水煎煮1 h，濾渣再次加水煎煮、過濾；將濾液合并，1∶1濃縮。再加入95%乙醇沉淀12 h，取沉淀物干燥稱重、溶解在蒸餾水中，靜置后將上清液取出，加入95%乙醇再沉淀12 h。將沉淀物離心、蒸干、稱重，計算提取率。

1.1.2 藥品及主要試劑 DMEM、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清由Gibico公司提供。皮膚黑素瘤細胞株A375由廣州往圣生物科技有限公司購買。RT試劑盒、Real time PCR試劑盒采購自TAKARA公司。Trizol購自Invitrogen公司。引物由上海捷銳生物科技有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米須提取物對A375細胞體外遷移能力影響[4]超凈臺中常規(guī)培養(yǎng)A375細胞(10%胎牛血清、青霉素100 μg/mL、鏈霉素50 μg/mL、高糖DMEM、37℃、5% CO2)于24孔培養(yǎng)皿，傳代12 h后，用200 μL移液槍槍頭作劃痕，100倍鏡下拍照。然后，分別加入配制好的3種濃度的玉米須提取物，使終濃度分別為：30、3、0.3 μg/mL。空白對照組不加藥液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，100倍鏡下拍照。實驗組每個組別、對照組均設(shè)置三個復(fù)孔。

1.2.2 玉米須提取物對A375細胞遷移相關(guān)基因影響 超凈臺中常規(guī)培養(yǎng)A375細胞于6孔培養(yǎng)皿，然后加入配制好的玉米須提取物，使終濃度為3 μg/mL。空白對照組不加藥液。實驗組和對照組均設(shè)置三個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，Trizol法提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄及real time PCR檢測，基因表達量以2-△Ct方法計算[5]，相對表達量的內(nèi)參基因為beta actin。根據(jù)在遷移中扮演的角色，Nguyen等將與遷移相關(guān)的基因分為維持腫瘤惡性表型的基因、轉(zhuǎn)移起始基因、轉(zhuǎn)移進展基因和轉(zhuǎn)移毒力基因四類[6]。維持腫瘤惡性表型基因參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，是維持腫瘤細胞惡性表型(無限增殖、基因組不穩(wěn)定、自我更新、逃避死亡和免疫、乏氧耐受等)和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的必要條件，但這些基因并不直接介導(dǎo)腫瘤的轉(zhuǎn)移[6]。此外，轉(zhuǎn)移毒力基因參與轉(zhuǎn)移克隆的形成和擴增，提高轉(zhuǎn)移腫瘤在新環(huán)境中的選擇性優(yōu)勢，但這些基因與原發(fā)腫瘤的生長和發(fā)展關(guān)系不大。因此，本研究只檢測遷移起始基因、遷移進展基因。其中，遷移起始基因包括：TWIST1、SNAI1、SNAI2、VIM、MTDH，遷移進展基因包括：TGFB1、IL11、PTGS2、STAT3、KLF17。檢測引物見表1。

2 結(jié)果

2.1 提取結(jié)果 玉米須初重為1 kg，提取物為29.8 g，提取率為29.8 g/kg。

2.2 玉米須提取物對A375細胞遷移能力的影響 玉米須提取物能顯著抑制A375細胞遷移能力，且呈濃度依賴性，濃度越高，抑制效果越明顯(圖1)。

表1 檢測基因引物

2.3 玉米須提取物對A375細胞遷移能力相關(guān)基因的影響 玉米須提取物能下調(diào)TWIST1、SNAI1、SNAI2、VIM的表達量，上調(diào)PTGS2基因表達量，而對MTDH、TGFB1、IL11、、STAT3、KLF17表達量無顯著影響(圖2)。

圖1 a-d: 0、30、3、0.3 μg/mL玉米須提取物對A375細胞遷移能力的影響

圖2 玉米須提取物對A375細胞遷移相關(guān)基因的影響

3 討論

黑素瘤是一種侵襲性強的皮膚惡性腫瘤，近年來逐漸成為常見惡性腫瘤[7]。其進展迅速，極易轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，嚴(yán)重危害人類健康。早期黑素瘤主要通過手術(shù)切除治療，但對晚期轉(zhuǎn)移性黑素瘤，目前治療手段收效甚微。

昌友權(quán)等[2]發(fā)現(xiàn)玉米須提取物對小鼠的MFC、Hep及S180腫瘤模型均有抑制作用，且此作用可能是通過增加荷瘤小鼠的免疫器官重量及吞噬功能、保護白細胞、促進T細胞轉(zhuǎn)化增殖、提高小鼠的細胞免疫活性而實現(xiàn)，但在體外實驗中未檢測到玉米須提取物的抑瘤作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)玉米須提取物對皮膚黑素瘤A375細胞的遷移能力具有顯著抑制作用，而且此作用呈濃度依賴性。 本研究未檢測玉米須提取物對A375細胞生長能力的作用。

我們進一步研究了玉米須提取物體外抑制黑素瘤A375細胞遷移能力的分子機制。發(fā)現(xiàn)玉米須提取物可下調(diào)遷移起始基因(TWIST1、SNAI1、SNAI2、VIM)的表達量，而對遷移進展基因(TGFB1、IL11、STAT3、KLF17)無顯著影響。事實上，TWIST1、SNAI1、SNAI2、VIM基因是腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[8]。我們的研究表明，玉米須提取物可抑制皮膚黑素瘤A375細胞的EMT。已經(jīng)證實，EMT是腫瘤遷移必經(jīng)階段。因而，我們認(rèn)為玉米須提取物可通過抑制EMT而抑制皮膚黑素瘤A375細胞的遷移能力。

玉米須提取物含有多糖、皂苷、揮發(fā)油、生物堿、植物甾醇類化合物等具有生物學(xué)功能的成分[9-11]。由于時間、條件限制，本研究未對玉米須提取物進一步分離、純化，找出抑制遷移的主要成分。此外，玉米須提取物下調(diào)TWIST1、SNAI1、SNAI2、VIM基因表達量的詳細機制亦有待進一步探索。

總之，玉米須提取物抑制皮膚黑素瘤遷移能力，下調(diào)EMT相關(guān)基因表達，可能是潛在的抗皮膚黑素瘤遷移藥物。

[1] 賈淑杰,王蕾,李旭.玉米須提取物的小鼠急性毒性實驗及降血糖作用觀察[J].天津醫(yī)藥,2012,40(8):809.

[2] 昌友權(quán),王維佳,楊世杰,等.玉米須提取物抗腫瘤作用的實驗研究[J].營養(yǎng)學(xué)報，2005,(06):498-501.

[3] 柏樺,海春旭,梁欣,等.玉米須提取物清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用[J].癌變.畸變.突變，2008,20(1):36-40.

[4] 吳包金.CXCR4基因沉默對黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移影響的實驗研究[D].上海:第二軍醫(yī)大學(xué),2009.

[5] 汪陽.miR-199a調(diào)控黑色素瘤細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選[D].長沙:中南大學(xué),2010.

[6] 蘇丹,祁鳴.腫瘤轉(zhuǎn)移分子機制研究進展[J].中國腫瘤，2012,(09):686-690.

[7] 耿濤,宋鑫.MicroRNA與黑色素瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究進展[J].實用腫瘤雜志，2014,(01):18-23.

[8] 楊惠鈴,李繼功,溫寧.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與口腔鱗狀細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移機制的研究進展[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2015,(06):352-354.

[9] 張百明,趙致臻.玉米須提取物對膽汁淤積性肝病的改善作用研究[J].中國藥房，2010,(23):2130-2132.

[10] Lee J, Lee S, Kim SL, et al. Corn silk maysin induces apoptotic cell death in PC-3 prostate cancer cells via mitochondria-dependent pathway[J]. Life Sci,2014,119(1-2):47-55.

[11] Yang J, Li X, Xue Y, et al. Anti-hepatoma activity and mechanism of corn silk polysaccharides in H22 tumor-bearing mice[J]. Int J Biol Macromol,2014,64:276-280.

(收稿：2016-12-19 修回：2016-12-20)

Effects of corn silk extracts on the migration of melanoma cell line A375

WUJingying1,HUANGJinmei2,LIMingjiu3,GUDong1.

1.XinshaHospital,Nansha511473,Guangzhou,China; 2.TheDermatologyInstituteofGuangdong,Guangzhou510090,China; 3.TheChronicDiseasePreventionandTreatmentStation,PanyuDistrict,Guangzhou511400,China

WUJingying,E-mail:gwc19880401@163.com

Objective: To determine the effect and mechanisms of corn silk extracts on the migration of cutaneous melanoma. Methods: The skin melanoma cell line A375 was cultured and was treated by corn silk extracts in the concentration of 0.3, 3,30 μg/mL. The migration of A375 cells was detected by scratch-wound assay and the expression of migration related genes was detected by the Real time PCR. Results: The migration number of A375 cells in the group of corn silk extracts was less than that in the blank group and the higher the concentration, the less migration number was. Compared to the blank group, the expression level of EMT associated genes (TWIST1, SNAI1, SNAI2 and VIM) was lower and the expression level of PTGS2 was higher in the group of corn silk extracts. Conclusion: The corn silk extracts can inhibit the migration of the skin melanoma and increase the expression of EMT related genes.

corn silk extracts; melanoma; migration; EMT

1廣州市南沙區(qū)新沙醫(yī)院，廣東廣州，511473 2廣東省皮膚病研究所，廣東廣州，510090 3廣州市番禺區(qū)慢性病防治站，廣東廣州， 511400

吳敬英，E-mail: annawqx@sina.com