分子印跡技術在獸用抗生素殘留分析中的應用進展

王曉通，張曉彤，謝曉程，玄 藝，李建科，成子強，李臣貴, 2*

(1.山東農業大學動物科技學院，山東泰安 271018；2.山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，山東泰安 271018)

隨著集約化養殖業的發展，獸用抗生素在動物疫病防治中發揮了重要作用。但不合理甚至違法添加使用抗生素導致的殘留現象已嚴重危害人類健康，因此建立靈敏可靠的分析方法對于控制獸用抗生素殘留，保護食品安全具有重要意義。當前，用于獸藥殘留檢測的法定方法主要有氣相色譜法(GC)[1]、高效液相色譜法(HPLC)[2]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[3]和液相色譜-質譜法(LC-MS)[4]等，這些方法檢測靈敏度高，準確性好，可對殘留獸藥同時進行定性和定量檢測，但色譜及質譜設備精密，對分析樣品要求高，在檢測獸藥殘留時需要進行大量的提取、凈化和富集等前處理操作，消耗大量有機溶劑和時間。隨著科學技術的發展，分子印跡技術在獸用抗生素殘留檢測領域正展現出巨大應用潛力。 分子印跡技術(Molecular Imprinting Technology, MIT)是一種分離目標分子的技術，通過人為設計，以目標分子作為模板，利用在結構上與模板相互補的分子作為功能單體，彼此之間發生特異性結合，在體系中加入交聯劑、引發劑、溶劑共同參與聚合反應，合成具有特定模孔結構的分子組合體(圖1)[5]。這種組合體具有預定的空間尺寸結構，可以與模板分子發生特異性結合，分子印跡聚合物具備靈敏度高、特異性好的優點，在獸藥殘留分析領域具有廣闊的應用前景。

圖1 分子印跡技術圖示[5]Fig 1 Diagram of Molecular Imprinting Technology[5]

1 分子印跡聚合物制備方法進展

制備特異性高、吸附性能好的分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers, MIPs)是分子印跡技術成功的關鍵，傳統制備MIPs的方法主要有本體聚合法、沉淀聚合法和懸浮聚合法等，這些方法存在產率低、聚合物粒徑較大、模板分子難以完全去除和印跡效果差等缺點。近年來關于MIPs的最新制備方法有表面分子印跡法、原子轉移自由基聚合法、可逆加成-斷裂鏈轉移聚合法、電聚合法和原位聚合等。

1.1 表面分子印跡法 表面分子印跡需要有特定的固相基質作為功能載體，在載體表面上發生聚合反應形成結構為“核-殼型”的聚合物。此方法具有分子識別速率快，模板易于洗出，重復利用率高等優點。陸雅婷等[6]利用磁性分子Fe3O4作為功能載體，馬兜鈴酸Ⅰ為模板分子，制備了表面磁性分子印跡顆粒，將其作為固相吸附劑，用于分離檢測中藥內含有的馬兜鈴酸，避免該物質進入人體后對機體產生毒性作用，該方法將磁分離技術與表面分子印跡技術結合起來，表現出檢測迅速，專一性強的優點。Wang等[7]以有機金屬骨架(UiO-66-NH2)作為載體，谷胱甘肽為模板分子，采用表面分子印跡法制備了一種新型的聚合物MIP@UiO-66-NH2，試驗表明，該印跡材料對脫脂牛奶中的谷胱甘肽有很好的識別結合能力，能從樣品中特異性分離出谷胱甘肽，適用于乳制品中痕量物質的檢測。

1.2 原子轉移自由基聚合 原子轉移自由基聚合(Atom Transfer Radical Polymerization，ATRP)是一種活性可控的自由基聚合方式 ，ATRP體系中單體選擇范圍較廣，使用有機鹵化物作為聚合反應的引發劑，過渡金屬作為催化劑。聚合反應的發生是通過控制鹵原子的轉移，建立自由基的增長和休眠鏈之間的動態平衡，金屬催化劑會加速并可逆性猝滅正在增長的自由基，使其保持在較低濃度便于控制聚合反應。Zheng等[8]首次利用雙重ATRP進行超靈敏的電化學DNA檢測，第一個ATRP的單體作為第二個ATRP的引發劑，將經過修飾的雙ATRP連接在電極表面，該生物電化學傳感器在人血清中可以進行特異性的檢測。Xu等[9]首次在未使用有機金屬作為催化劑的前提下進行ATRP聚合，體系中有少量氧氣存在，使用有機染料熒光素為光催化劑，溴苯乙酸乙酯為引發劑，在藍色光下引發聚合，聚合體系的動力學來自胺電子給體的位阻，該方法合成的聚合物無過渡金屬的污染，對實現ATRP的產業化有重大意義。

1.3 可逆加成-斷裂鏈轉移聚合 可逆加成-斷裂鏈轉移聚合(Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization，RAFT)屬于活性自由基聚合，在RAFT聚合中選用雙硫酯類化合物作為聚合體系的鏈轉移劑，再通過改變引發劑與鏈轉移劑濃度的比值，達到活性可控的目的，將聚合過程維持在活性自由基與休眠自由基之間的動態平衡狀態。RAFT聚合條件溫和，單體適用范圍廣，聚合過程易于控制。Ali等[10]利用RAFT法在磁性載體上制備了分子印跡聚合物，將其作為固相吸附劑用于分析檢測水中的多環芳烴，達到了定量和定性檢測的效果。Murat等[11]通過RAFT聚合在聚苯乙烯細胞(Ps)培養皿上，接枝了聚丙烯酰胺和聚N-異丙基酰胺雙聚合物層，通過RAFT將兩個聚合物層的厚度控制在100 nm，有利于細胞表層的恢復，通過水接觸角測量表明，雙層聚合物在水中有溫度依賴性的界面特征，經過接枝后的Ps培養皿表現出對各種細胞均無細胞毒性，該技術可用于構建各種類型的生物材料表面。

1.4 電聚合 電聚合就是將電極插入混有模板、功能單體的溶液中，在通電的條件下引發聚合，聚合物沉積在電極表面形成薄膜，當MIPs結合目標分子時會產生信號輸出，通過計算機屏幕可觀察到整個過程，通過控制電流的強度調整聚合物薄膜的厚度，該方法制備的基于MIPs的電化學傳感器擁有便捷性與快速性的優點，已在電分析領域得到廣泛應用。Rosa等[12]以甲酮為模板分子，2-巰基苯并咪唑為功能單體，利用電聚合法在絲網印刷金電極上進行分子聚合，將其作為傳感器，用于對人體液中是否含有甲酮物質進行特異性檢測。利用該原理也可用于對其他非法藥物的檢測。Wei等[13]基于電聚合制備了以木犀草素為模板的分子印跡聚合物，將其作為電化學傳感器用于測定傳統藥物中木犀草素，通過循環伏安掃描可以輕松除去模板，對比常規的檢測方法，MIPs電化學傳感器具有特異性好，穩定性強的優點。

1.5 原位聚合 原位聚合是直接將聚合所需模板、單體、交聯劑、引發劑在溶劑中分散，將其裝填在色譜柱或者毛細管柱內就地聚合，操作簡單、直接，具有很強的適用性。Bai等[14]通過原位聚合法在經過石墨烯修飾的玻璃碳電極表面合成了MIPs，構造了新型電化學傳感器碳電極，用于從復雜基質中檢測青蒿素，并且在結構類似物的混合溶液中對青蒿素表現出良好的選擇性。Min等[15]以原位聚合的方式制備MIPs，用于檢測血液肌酐水平，結果表明利用原位聚合法制備的聚合物對肌酐的印跡因子達到3.06，表現出良好的吸附性能。

2 MIT在獸用抗生素殘留檢測中的最新研究進展

β-內酰胺類、大環內酯類、酰胺醇類、四環素類、喹諾酮類等是常用的獸用抗生素。隨著公眾對動物源性食品安全的重視，迫切需要建立靈敏可靠的抗生素殘留分析方法。MIT具有特異性強、簡單易操作的優點，在獸用抗生素殘留檢測中得到越來越多的應用。

2.1 β-內酰胺類殘留檢測 β-內酰胺類抗生素主要包括青霉素類和頭孢菌素類，通過抑制繁殖期細菌細胞壁的合成殺死細菌，常見藥物有青霉素、阿莫西林、頭孢克肟等。β-內酰胺類抗生素主要用于敏感革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性球菌引起的動物疾病的治療，在人體中蓄積會有肝腎毒性以及過敏反應。我國農業農村部[16]規定β-內酰胺類在動物性食品中的殘留限量為50 μg/kg，奶制品中殘留限量為4 μg/kg。

郭利輝[17]以苯唑西林為模板分子，丙烯酰胺作為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯作為交聯劑，甲醇作為反應溶劑，在偶氮二異丁腈存在下引發聚合，成功制備了MIPs，將其作為固相萃取柱，用于檢測畜產品中β-內酰胺類抗生素的痕量殘留，特異性吸附效果好，對苯唑西林的吸附量最大為418.23 μmol/g。陳郎星等[18]將經過雙鍵修飾的Fe3O4@SiO2作為分子印跡的固相基質，合成了特異性吸附萘夫西林的分子印跡聚合物，結合使用磁分離技術，對目標物實現了快速分離檢測的目的，對制得的磁性分子印跡聚合物進行吸附性能表征，結果顯示，MIPs對混合溶液中的萘夫西林表現出優良的選擇性，有較強的抗干擾能力。李橋等[19]利用分子印跡技術，結合使用有機金屬材料UiO-66，通過皮克林乳液法合成制備了MIPs微球，可用于動物性食品中阿莫西林的檢測，特異性吸附最大容量達到0.1721 mmol/g。

2.2 大環內酯類殘留檢測 大環內酯類抗生素通過抑制細菌蛋白的合成發揮抗菌作用，常見的藥物有紅霉素、泰樂菌素、替米考星等。生產中常用于治療畜禽的呼吸道疾病，在人體中蓄積會產生急性肝中毒。

Zeng等[20]以泰樂菌素為模板，甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯為功能單體，模板與單體之間的比例為0.5∶1，將疏水性二甲基丙烯酸乙二醇酯(Ethyleneglycol Dimethacrylate, EGDMA)和親水性N, N-亞甲基雙丙烯酰胺(Methylene-Bis-Acrylamide，MBAA)作為混合交聯劑，制備了應用于水環境的印跡聚合物，體系中加入硼酸提高了在水環境的穩定性，通過分子動力學模擬試驗，表明分子聚合物內的空腔結構、大小與模板匹配，在水中該聚合物具有識別結合迅速，特異性強的優點，通過Scatchard作圖分析，表明對泰樂菌素的吸附能力為74.3 mg/g，最大吸附容量為120.0 mg/g，利用該技術可以檢測水環境中大環內酯類藥物的殘留。Hu等[21]將分子印跡技術與電化學發光傳感器結合運用，成功對樣品中的阿奇霉素進行了檢測，對比分子印跡電極與非分子印跡電極的電化學發光行為，在含2×10-7mol/L阿奇霉素的緩沖溶液中進行響應強度的測試，結果顯示分子印跡電流信號強度優于非分子印跡電流信號強度，說明經過分子印跡修飾后的電極靈敏性增強，特異性吸附效率為98.4%，分子印跡電化學發光傳感器對阿奇霉素的檢測極限為2.3×10-11mol/L，表明該項檢測技術可實現對藥物殘留的微量檢測。Liu等[22]將分子印跡技術與色譜技術結合，對發酵液中的螺旋霉素I進行檢測，以甲基丙烯酸甲酯作為功能載體，丙烯酰胺和甲基丙烯酸制備成殼，合成了吸附螺旋霉素I的“核-殼型”分子印跡聚合物，經過分子印跡色譜柱再生試驗表明，5次循環利用后容量損失約為3.4 mg/g，印跡聚合物動態吸附容量為20.0 mg/g，表明MIP色譜法在分離螺旋霉素中有較強的實用價值。

2.3 酰胺醇類殘留檢測 酰胺醇類抗生素通過干擾細菌蛋白的復制發揮抗菌作用。常用藥物有氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素等，其中氯霉素對人體危害極大，會抑制骨髓造血功能，導致白血病的發生，還會引起致命的“灰嬰綜合征”反應，現已被禁用。分子印跡技術對于氯霉素的痕量檢測有著獨特的優勢。

蔣彩云等[23]采用熱聚合法，合成了特異性吸附氯霉素的印跡聚合物，最大吸附量為127.8 mg/g，通過吸附動力學試驗表明，氯霉素印跡聚合物在2 h達到了吸附平衡，該聚合物在甲砜霉素、氟甲砜霉素和氯霉素的混合溶液中，表現出選擇性好、特異性吸附高的優點，可用于動物性產品中氯霉素的痕量檢測。章琦等[24]利用表面分子印跡法，選用Fe3O4作為磁性載體材料，制備了特異性吸附氯霉素的磁性印跡聚合物，用于檢測牛奶制品中的氯霉素，通過磁分離技術僅需10 min就可以使MIPs對氯霉素的吸附達到飽和狀態 ，檢出限為2.7 μg/kg，回收利用率在97.3%～104.3%之間。Mohamed 等[25]以SiO2粒子作為載體材料，通過雙鍵改性后，制備了吸附氯霉素的分子印跡聚合物，聚合體系中有機硅烷作為改性劑，提高印跡物在水溶液中的穩定性，該方法制備的分子聚合物，可用于從水溶液中吸附去除氯霉素。 Li等[26]以氯霉素為模板，并首次使用了丙烯酰胺和甲基丙烯酸作為雙功能單體，在經過雙鍵修飾的Fe3O4磁性載體上合成制備了MMIPs，與以往方法不同的是，該方法引入了兩個不同的功能單體作為識別位點，提高了對氯霉素的特異性識別能力，最大吸附量達到了42.60 mg/g ，相對選擇因子≥10，可用于在復雜樣品中的分析檢測。

Fatemeh等[27]制備了一種基于納米結構分子印跡聚合物(MIP)的光學傳感器，該聚合物涂覆在發光的鋯金屬-有機骨架(MIP/Zr-LMOF)上，傳感器整合了Zr-LMOF和MIP的優勢，用于CAP的靈敏熒光檢測。將MIP涂層附著在Zr-LMOF表面，可提高Zr-LMOF對CAP的特異性識別能力，這是首次基于MIP的Zr-LMOF熒光傳感器用于CAP檢測的報道，檢測限量為0.013 μg/L，對牛奶、蜂蜜中的氯霉素殘留檢測達到了滿意的效果，該傳感器具有靈敏度高和選擇性好的優點，且具有良好的可重復使用性和穩定性。

2.4 四環素類殘留檢測 四環素類抗生素通過阻礙細菌蛋白質的合成從而抑制細菌生長，常見藥物有四環素、土霉素、多西環素等，在人體中蓄積會有肝臟毒性，抑制骨骼和牙齒的發育。GB31650-2019食品國家安全標準[16]中規定，在動物源性肌肉食品中，四環素類抗生素殘留限量為200 μg/kg，奶制品中的殘留限量為100 μg/kg。

Emel等[28]以四環素為模板，N-甲基丙烯酰基-L-谷氨酸甲酯為功能單體，合成制備MIPs，并將其嵌入復合冷凍凝膠中，用于選擇性分離水中的四環素 ，冷凍凝膠可以提高分子印跡聚合物的化學耐性，延長了使用壽命。Wang等[29]以四環素為模板分子，Fe3O4為功能載體，甲基丙烯酸為功能單體，玉米醇溶蛋白作為交聯劑，合成了表面磁性分子印跡聚合物，并結合使用電化學傳感器，對動物源性食品中的四環素進行了精準快速的檢測與分離，檢測限度為0.025 μg/mL，實現了對四環素類藥物的痕量檢測。

2.5 喹諾酮類殘留檢測 喹諾酮類抗生素通過阻止細菌DNA的合成殺死細菌，常用藥物為諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星等。可用于治療動物的呼吸道、泌尿道、消化系統的感染，對人體的毒副作用表現為二重感染和菌群失調，對未成年人的軟骨產生損害。GB31650-2019食品國家安全標準[16]中規定可以使用但有最大殘留限量的是達氟沙星、恩諾沙星、二氟沙星、沙拉沙星、噁喹酸這五種，其他喹諾酮類藥物均已禁用。

Chen等[30]通過表面分子印跡技術，以Fe3O4為磁性載體材料， Mn-Zns量子點為熒光材料，制備了基于磁性分子印跡聚合物和磷光材料的新型探針，聚合物是以諾氟沙星為模板，3-氨基丙基三乙氧基硅烷為功能單體，在四乙氧基硅烷存在下交聯聚合。該探針具有靈敏度高、檢測迅速、造價低廉的優點。檢測限度在0.80 μg/L，成功應用于動物性食品中諾氟沙星的殘留檢測。Qin等[31]在經過活化的SiO2顆粒上，以諾氟沙星為模板，加入甲基丙烯酸、乙二醇雙甲基丙烯酸酯分別作功能單體和交聯劑，反應形成印跡聚合物，再將MIPs用作固相萃取劑，結合高效液相色譜分析，對海水中諾氟沙星的殘留量進行了檢測，檢測限為2 μg/L，回收率在75.5%～91.7%。Zhao等[32]在有機金屬骨架材料表面，建立了識別加替沙星的分子印跡聚合物。將其作為吸附劑從牛血清中檢測加替沙星的殘留量，在恩諾沙星、環丙沙星和加替沙星的混合溶液中，該聚合物表現出優良的特異性吸附能力。

3 小 結

分子印跡技術具有特異性強、靈敏度高、易于操作的優點，為獸用抗生素殘留檢測提供了新方法，近年來，研究人員嘗試將分子印跡聚合物進行優化改造，結合使用磁性材料[24]、熒光技術[33]、高效液相色譜分析技術[34]等提高檢測效率與準確性。磁性材料的使用是實現快速檢測獸用抗生素殘留的主要趨勢，熒光材料的使用可以對目標物進行定性與定量分析，基于分子印跡技術原理開發使用的獸用抗生素殘留檢測技術將具有廣闊的市場應用價值。