非班太爾對照品的定值研究

馬秋冉，張 璐，董玲玲，范 強，張秀英

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

非班太爾(Febantel)，又名苯硫胍，其化學名稱為[[2-(甲氧乙酰氨基)-4-(苯硫基)苯基]亞氨羰基]二氨基甲酸二甲酯，最先由德國拜耳制藥公司研制成功[1]，主要用于治療和控制動物的胃腸蛔蟲、絳蟲等蠕蟲[2-3]。非班太爾沒有單獨使用的劑型，通常將其與吡喹酮和噻嘧啶聯合使用制成復方非班太爾片，作為寵物驅蟲藥[4]。經國家獸藥基礎信息查詢系統顯示，已有3個廠家獲批該制劑的新藥證書并生產銷售。在生產過程中，需使用非班太爾、吡喹酮和噻嘧啶對照品作為標尺，衡量產品質量。目前，國內已供應吡喹酮和噻嘧啶對照品，而非班太爾對照品只能依賴進口，其價格昂貴、購買周期長和供應不及時等問題，給國內企業的研發與生產帶來不便。因此，為了更好地對該品種進行質量控制，降低企業研發生產成本，研制首批非班太爾對照品。本文根據《標準物質定值的通用原則及統計學原理》[5]和《中華人民共和國獸藥典》2015年版[6]的要求，分別采用質量平衡法和差示掃描量熱法(DSC法)2種方法對非班太爾對照品的含量進行定值研究。其中，質量平衡法[7]也稱為雜質扣除法，是通過測量其中所有雜質的含量，從100%中減去雜質的質量分數，獲得主成分的質量分數即含量的方法。本文以高效液相色譜法作為有機雜質檢查方法，以卡爾費休氏滴定法作為水分檢查方法，以氣相色譜法作為可揮發性溶劑檢查法，以熾灼殘渣檢查法作為不可揮發性雜質檢查法。DSC法基于熱動力學原理，通過度量非班太爾對照品中的總雜質絕對含量來對其進行定值，該方法適用于加熱過程中不發生熱分解、不與外界產生熱效應的有機純物質的定值測定[8]。2種方法的測定能夠更好地保證非班太爾對照品賦值的準確性。

1 儀器與試藥

儀器、試驗材料與試劑：Waters e2695 高效液相色譜儀(Empower 2 色譜工作站)，Waters 2998 二極管陣列檢測器(PDA)，Waters 2489 紫外檢測器(UV)，Mettler XS205 電子分析天平(精度0.01 mg)，Agilent 7698A 氣相色譜儀，Agilent 7697A頂空進樣器，瑞士萬通701KF水分測定儀，美國TA Q200 DSC儀，CWF11/5 馬弗爐。

非班太爾精制原料由陜西漢江藥業集團股份有限公司提供(批號為1533015)，非班太爾系統適用性對照品由EP提供(批號為1.1)，甲醇、乙腈、四氫呋喃均為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純。

2 方法與結果

2.1 非班太爾對照品制備 采用紅外分光光度法、紫外-可見分光光度法、元素分析法、X射線衍射法、核磁共振法、質譜法對非班太爾精制原料進行結構確認，測定結果與目標結構一致。將非班太爾精制原料分裝成500份(每份約100 mg)，遮光密閉，在2～8 ℃ 保存。非班太爾結構如圖1所示。

圖1 非班太爾結構圖Fig 1 Strucure of febantel

2.2 質量平衡法定量

2.2.1 純度分析

2.2.1.1 色譜條件與系統適用性 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸二氫鉀(取磷酸二氫鉀6.8 g，置1000 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度)-乙腈(60∶40)為流動相；檢測波長為280 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。雜質A、雜質B和雜質C的分離度應符合要求。

2.2.1.2 溶劑空白制備 混合溶液(乙腈∶四氫呋喃=1∶1)。

2.2.1.3 供試品溶液制備 取非班太爾對照品樣品10 mg，置10 mL量瓶中，用混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.1.4 系統適用性溶液制備 取非班太爾系統適用性對照品(含雜質A、雜質B和雜質C)5 mg溶于1 mL混合溶液，搖勻，即得。

2.2.1.5 測定結果 按2.2.1.3項下配制方法，平衡制備6份供試品溶液。精密量取溶劑空白、系統適用性溶液和供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。其中溶劑空白(圖2)對非班太爾測定無干擾；系統適用性色譜圖(圖3)中，雜質A、B、C和非班太爾峰與相鄰色譜峰的分離度均符合要求；從供試品溶液色譜圖(圖4)可知，非班太爾對照品樣品中有關物質包括雜質A、雜質B和2個未知雜質。按自身對照法以峰面積計算，非班太爾對照品樣品純度分別為：99.880%、99.907%、99.900%、99.903%、99.898%、99.901%，均值(n=6)為99.898%，標準偏差為0.009%。

圖2 溶劑空白色譜圖Fig 2 Liquid chromatogram of blank solution

圖3 系統適用性溶液色譜圖Fig 3 Liquid chromatogram of system suitability solution

圖4 供試品溶液色譜圖Fig 4 Liquid chromatogram of test solution

2.2.2 水分 參照《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部附錄限量檢查法(水分測定法)，采用卡爾費休氏滴定法測定。實驗前，精密稱取標準水約20 mg，注入水分測定儀，標定滴定液，平行標定3次，3次連續標定結果的相對偏差小于1%。精密稱取非班太爾對照品樣品100 mg，迅速打開滴定池上玻璃塞將其置于反應瓶中，儀器觸控面板處輸入樣品稱樣量，滴定結束后系統自動顯示計算含水量。平行測定6份，結果為0.068%、0.063%、0.067%、0.081%、0.084%、0.074%，均值(n=6)為0.073%，標準偏差為0.008%。

2.2.3 熾灼殘渣 參照《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部附錄限量檢查法(熾灼殘渣檢查法)試驗。平行測定6份，結果為：0.064%、0.056%、0.050%、0.045%、0.059%、0.054%，均值(n=6)為0.055%，標準偏差為0.007%。

2.2.4 殘留溶劑 參照《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部附錄限量檢查法(殘留溶劑測定法)，采用頂空進樣方式。根據非班太爾精制原料合成路線可知，殘留溶劑為甲醇。

2.2.4.1 氣相色譜條件 以氰丙基苯基聚硅氧烷為固定液(DB624 Agilent毛細管色譜柱320 μm×1.8 μm，30 m)；起始溫度為50 ℃，保持5 min，然后以每分鐘15 ℃的速率升溫至180 ℃，保持3 min；進樣口溫度為200 ℃；氫火焰離子化檢測器(FID)溫度為230 ℃；氮氣為載氣，流速為1 mL/min，分流比20∶1；頂空進樣器平衡溫度80 ℃，平衡時間30分鐘，傳輸線溫度為120 ℃。

2.2.4.2 空白溶劑制備 取N,N-二甲基甲酰胺(DMF)1 mL置20 mL頂空瓶中，立即用壓蓋器密封。

2.2.4.3 對照品溶液制備 取甲醇約30 mg置100 mL量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL置20 mL頂空瓶中，立即用壓蓋器密封。

2.2.4.4 供試品溶液制備 取非班太爾對照品樣品約100 mg，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，加1 mL DMF溶劑溶解，立即用壓蓋器密封。

2.2.4.5 按2.2.4.4項下配制方法，平衡制備6份供試品溶液。按2.2.4.1項下色譜條件進行測定。結果為0.106%、0.106%、0.101%、0.100%、0.106%、0.104%，均值(n=6)為0.104%，標準偏差為0.003%。

2.2.5 質量平衡法計算 選用格拉布斯(Grubbs)準則，對上述試驗數據是否存在可疑值進行判別，結果顯示無可疑值。以含量=純度×(1-水分含量-熾灼殘渣含量-殘留溶劑含量)×100%為公式，計算非班太爾對照品樣品含量(表1)。

表1 質量平衡法定值結果Tab 1 The result of mass balance method(%)

2.3 差示掃描量熱法定值

2.3.1 測定條件 測量采用動態法，連續加熱使樣品熔融，獲得數據。升溫速率：1 ℃/min；升溫區間：110～140 ℃；爐內氣體：氮氣。

2.3.2 樣品制備 平行稱取6份，分別置40 μL的標準AL2O3坩堝中，壓蓋。

2.3.3 測定結果 6份樣品的測定結果為99.61%、99.71%、99.63%、99.60%、99.65%、99.63%，均值(n=6)為99.64%，標準偏差為0.039%。差示掃描量熱曲線見圖5。

2.4 兩種方法含量定值結果等精度檢驗 采用科克倫法對兩種方法定值結果進行等精度判定。科克倫計算公式：

Si為每種方法單次測量的標準偏差；Smax為Si中最大值。判斷準則：當C≤C(α,m,n)時，表明組數據平均值間為等精度，反之判為不等精度。其中m為實驗測量組數，n為每組實驗檢測次數，α取0.05。C=0.0182/(0.0182+0.0392)=0.18，查科克倫檢驗臨界值表，得C(0.05,2,6)=0.8534。說明兩種方法互為等精度，因此取算術平均值作為最終定值結果，即非班太爾含量定值結果為99.7%。

2.5 均勻性檢驗 根據JJF 1006-1994《一級標準物質技術規范》和JJF1343-2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》的技術要求，本研究從已分裝的500瓶非班太爾對照品中隨機抽取15個包裝單元進行均勻性檢驗，對隨機抽取的樣品從1到15編號，每個單元取3個子樣，按2.2.1項下方法進行均勻性檢驗，測量的數據采用單因素方法分析進行統計檢驗，非班太爾均勻性檢驗結果如表2所示。F

表2 均勻性檢驗結果Tab 2 The result of homogeneity test

2.6 穩定性考察 為考察非班太爾對照品在長期儲存條件下以及外部環境變化條件影響下，特性量值保持不變的能力，本研究按照《標準物質定值的通用原則與統計學原理》的有關要求，按2.2.1項下方法開展了長期和短期的穩定性考察。長期穩定性考察分別在第0、1、3、6、9、12個月進行考察；短期穩定性考察，則將樣品分別置于高溫(60 ℃)、高濕(90% ± 5%，25 ℃)、光照(照度4500 Lx±500 Lx)條件下，分別于2、4、6、8、10 d進行考察。采用趨勢分析對穩定性監測結果進行考察，若|b1|

表3 長期穩定性與短期穩定性統計Tab 3 The statistics of long-term and short-term stability test

2.7 不確定度評估 根據非班太爾對照品研制過程，詳細分析了每個環節引入的不確定度。不確定度主要由3部分組成，即均勻性引入的不確定度、穩定性引入的不確定度(短期穩定性和長期穩定性)以及定值過程中引入的不確定度。

2.7.1 質量平衡法定值不確定度

2.7.3 均勻性與穩定性的不確定度 根據《標準物質定值的通用原則及統計學原理》中均勻性與穩定性不確定評估的計算公式，計算均勻性不確定度(uss)為0.0033%，穩定性不確定(us)為0.0072%。

3 小結與討論

本文采用質量平衡法和差示掃描量熱法聯合對非班太爾對照品進行定值，兩種方法測定含量的結果基本一致。經上述兩種定值方法的測定，非班太爾對照品最終定值結果為99.7% ± 0.3%，k=2，P=0.95。

其中，質量平衡法是一種具有較高準確度的方法，其能夠直接溯源到SI中質量單位(kg)，世界衛生組織及歐洲藥典均推薦使用該方法作為藥物標準物質的定值方法[9]。但該方法也具有一定的局限性，如不同雜質響應值的差異及色譜分離能力的限制，這些因素都將導致質量平衡法測定結果與實際值偏離。本文采用《歐洲藥典》非班太爾有關物質檢查方法的色譜條件作為純度分析方法，該方法能夠檢出非班太爾對照品的全部有機雜質，保證了純度分析的準確性。DSC法是一種熱分析方法，能夠在程序控制溫度下，測量輸入到試樣與參比物的功率差與溫度之間的關系，主要用于材料的研發、性能檢測與質量控制。近年來，科研工作者將該方法拓展用于化學藥品對照品的純度分析。劉毅[10]等采用該方法測定安替比林、異丙安替比林等化學藥品對照品純度。王路[11]等利用DSC法對熊果苷對照品進行定值研究，并制備出首批熊果苷對照品應用于化妝品行業的質量控制。DSC方法的測定結果受稱樣量、升溫速率、氣體種類影響較大。應根據樣品熱效應大小調節樣品量，通常為1～3 mg之間；DSC用于純度分析時升溫速率應在0.5～1 ℃/min，較快的升溫速率雖能提高靈敏度，但分辨率會顯著下降，造成測定結果偏差；使用惰性氣體可避免產生氧化反應峰，同時又可減少試樣揮發對監測器的腐蝕[12]。

本文首次對非班太爾對照品進行定值研究，其結果符合國家獸用對照品的相關要求，并已經過獸藥標準物質化學藥品專業委員會審批，可作為國家獸用標準品發放和使用。此次定值研究不僅填補了國內非班太爾在定值研究方面的空白，而且為我國獸藥行業的發展，特別是寵物用藥的發展提供了支持，具有重大意義。