倫敦沙門菌的流行與耐藥性分析

付莎莎，孫先譜，孫 凡，徐正中，2，焦新安，2，陳 祥，2

沙門菌是全球范圍內影響最廣的人獸共患病原菌之一，廣泛分布于人類、動物、食品和環境中，通過食物鏈、環境等多種途徑傳遞，危害人類健康[1]。據報道，全球每年大約有9 400萬腸胃炎患者，其中因沙門菌而死亡的有15.5萬人[2-3]。現已報道2 610種不同血清型的沙門菌[4]，倫敦沙門菌最先報道于20世紀40年代[5]，為E1群沙門菌，它是除鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌外引起腸道感染的常見血清型之一[6]。1980年匈牙利報道了倫敦沙門菌通過生肉和肉類制品進行傳播，這些菌株表現為多重耐藥，而在1976-1978年間收集的倫敦沙門菌為敏感菌株[7]。2000年，韓國報道了一起由倫敦沙門菌污染嬰兒配方奶粉引起的腸胃炎暴發，導致了31名嬰幼兒病例。近年來，國內外報道了多起由倫敦沙門菌引起的食源性疾病[8-10]，沙門菌食物中毒血清型變遷趨勢不容忽視。鄒志云等從220名健康食品從業人員中分離出17株倫敦沙門菌，耐藥率和多重耐藥率均在80%以上[11]。Yang等從218株沙門菌中鑒定出20株倫敦沙門菌，其中12株(60%)表現出耐藥性，10株(50%)表現為多重耐藥[12]。

本研究通過聚合酶鏈式反應(PCR)、生化與血清型鑒定，從不同宿主來源樣品中分離到135株倫敦沙門菌，通過測定倫敦沙門菌對18種抗菌藥物的最小抑菌濃度，分析其總體耐藥性和多重耐藥情況。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2016-2018年共分離135株倫敦沙門菌，采集自江蘇、新疆、河南、上海、山東5個省(市、區)，分別從豬(120株)、人(13株)、犬(1株)、雞(1株)樣品中獲得。依據生化實驗和腸毒素stn檢測[13-16]，判斷分離株是否為沙門菌。使用商品化抗血清(中國寧波天潤生物制藥有限公司、丹麥SSI)對每個菌株進行血清型鑒定[17]。參照國家標準(GB/T 4789.4-2016)方法及考夫曼懷特表對沙門菌進行血清型分型[18]。

1.2 抗菌藥物敏感性實驗 采用瓊脂稀釋法，測定135株倫敦沙門菌對18種抗菌藥物的敏感性：磷霉素(FOS)，氨芐西林(AMP)，呋喃妥因(NIT)，頭孢唑啉(CFZ)，環丙沙星(CIP)，頭孢噻肟(CTX)，氟苯尼考(FFC)，阿米卡星(AMK)，四環素(TET)，氨曲南(ATM)，慶大霉素(GEN)，氯霉素(CHL)，美羅培南(MEM)，鏈霉素(STR)，喹乙醇(OLA)，多粘菌素E(CL)，萘啶酸(NAL)，復方新諾明(SXT)。大腸桿菌ATCC 25922作為質控菌。

1.3 數據分析 除鏈霉素參考國家抗菌藥物耐藥性監測系統(NARMS)、多粘菌素E參考歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會(EUCAST)外，其余參照美國臨床標準委員會(CLSI)的藥敏標準[19]。

使用SPSS 25.0統計軟件，采用卡方檢驗比較不同宿主來源和不同環節菌株對抗生素耐藥率之間的差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 菌株的分離與鑒定 135株倫敦沙門菌采集自江蘇(14株)、新疆(4株)、河南(76株)、上海(40株)、山東(1株)5個省(市、區)。其中，來源豬的菌株有120株，分離自養殖環節(40株)、屠宰環節(76株)的豬糞便樣品和市場環節的豬龍骨(1株)、豬排(1株)、豬皮(1株)、豬肉餡(1株)；人源菌株有13株，來自體檢人員的糞便樣品；來源犬和雞的菌株各有1株，分別來自寵物犬的糞便和市場環節的雞翅。見圖1。所分離菌株的樣品來自于外觀健康個體。

JS：Jiangsu; SH：Shanghai; XJ：Xinjiang; SD：Shandong; HN：Henan圖1 菌株的地理分布和宿主來源Fig.1 Geographical distribution and host source of isolates

135株菌株經瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物片段大小均為260 bp。參照API 20 說明書進行細菌生化鑒定，結果判讀表及食品數據庫顯示135株菌株均為沙門菌。使用沙門菌屬診斷血清試劑盒進行血清型鑒定，分離株與O10因子、一相鞭毛H∶V和二相鞭毛H∶6發生凝集反應[20]。成功分離、鑒定出135株倫敦沙門菌。

2.2 倫敦沙門菌總體耐藥性分析 18種抗菌藥物敏感性實驗表明，135株倫敦沙門菌至少對1種抗生素表現耐藥。其中，分離株對四環素(95.6%)耐藥率最高，其次是鏈霉素(93.3%)、氨芐西林(87.4%)，菌株對氯霉素(68.9%)、復方新諾明(68.9%)和氟苯尼考(63.7%)處于中等耐藥水平，都在50%以上。氨曲南(8.9%)和頭孢噻肟(11.1%)抑菌效果較好，耐藥率在10%左右。倫敦沙門菌對阿米卡星、多粘菌素、呋喃妥因和美羅培南敏感，沒有檢測到耐藥菌株。見表1。

對于不同宿主來源的135株倫敦沙門菌，有129株倫敦沙門菌表現為多重耐藥，多重耐藥率達到95.6%。在120株豬源沙門菌中，有114株表現為多重耐藥，主要集中在4耐(20.0%，24/120)和9耐(26.7%，32/120)。其他來源的菌株多重耐藥率均為100%。

2.4 倫敦沙門菌在4個環節中的耐藥性及多重耐藥性分析 134株倫敦沙門菌分別從養殖環節(40株)、屠宰環節(76株)、市場環節(5株)和人的體檢樣品(13株)中分離出來(犬來源菌株不計入4個環節)。4個環節的倫敦沙門菌均對氨芐西林、四環素、鏈霉素、氯霉素和復方新諾明等具有較高的耐藥性，對阿米卡星、美羅培南、呋喃妥因和多粘菌素的耐藥率均為零，抑菌效果很好。養殖環節分離的菌株對于環丙沙星和萘啶酸的耐藥率較低，分別為2.5%和17.5%，人體檢樣品分離株的耐藥率高于60%。市場環節菌株對氨曲南、頭孢唑啉和頭孢噻肟的耐藥率均為零，體外抑菌效果較好。人體檢樣品分離菌株的耐藥率達到30%～40%，耐藥現狀較為嚴重。不同環節的菌株對于大多數抗生素耐藥率差別較大，如慶大霉素(χ2=120.994,P<0.01)、氟苯尼考(χ2=36.757,P<0.01)，菌株在養殖環節耐藥率最高，其次是屠宰環節，人的體檢樣品相對較低。

其中養殖環節多重耐藥菌株最多，主要集中在9耐(75%)。屠宰環節93.4%的菌株為多重耐藥菌株，主要集中在4耐、5耐和6耐；市場環節的菌株只有5株，但有4株表現為多重耐藥，主要集中在5耐和6耐；從人的體檢樣品分離出的菌株多重耐藥率達到100%，多重耐藥現象嚴重。

2.5 倫敦沙門菌主要多重耐藥表型分析 倫敦沙門菌多重耐藥嚴重，95.6%菌株表現為多重耐藥，且多重耐藥譜十分廣泛，本研究一共鑒定出38種多重耐藥表型(表2)。其中29株(21.5%)多重耐藥表型為AMP-CHL-FFC-FOS-GEN-OLA-STR-SXT-TET，為最常見多重耐藥譜，有22株(16.3%)表現為AMP-STR-SXT-TET。

表2 135株倫敦沙門菌多重耐藥表型Tab.2 Multidrug resistance phenotype of 135 Salmonella London strains

此外，有3種耐藥表型同時在豬源菌株與人源菌株中發現，分別為：AMP-CHL-STR-SXT-TET、AMP-CHL-FFC-STR-SXT-TET、AMP-CFZ-CHL-CIP-FFC-NAL-STR-SXT-TET。雞源菌株只有1種耐藥表型AMP-CHL-CIP-NAL-TET，且同時在豬源菌株中被發現。

3 討 論

在全球范圍內，沙門菌是引發食源性疾病的首要致病菌[21]。鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌是公認的引起食源性疾病的優勢血清型，但近年來倫敦沙門菌作為僅次于鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌的常見血清型[22-24]，數量不斷增多[25]。因此，及時對倫敦沙門菌的耐藥和流行情況進行檢測和監測，將對食品安全與公共衛生具有重要意義。

本研究從健康宿主中成功分離、鑒定出135株不同宿主來源的倫敦沙門菌。其中，近90%菌株來源于豬，與現有報道相一致[12,26-28]。此結果表明倫敦沙門菌已成為人類健康的潛在威脅，人類很容易因誤食污染的豬肉制品而感染倫敦沙門菌。除此之外，倫敦沙門菌的常見宿主還有14歲以下的兒童[24,29]、食品從業人員[11]、動物源性食品[30-31]等。上述文獻顯示倫敦沙門菌主要通過污染肉制品、動物內臟、水產品等進行傳播，進入人體后主要定居在腸道中，其釋放的毒素可引發人體出現惡心、腹瀉、發熱、頭痛等癥狀。

總體耐藥性分析顯示，倫敦沙門菌普遍對氨芐西林(87.4%)、鏈霉素(93.3%)、四環素(95.6%)和復方新諾明(68.9%)耐藥率高，對頭孢噻肟(11.1%)耐藥率較低，與江蘇省無錫市[11]、貴州省[32]的報道相一致。但與其不同的是，在無錫市和貴州省的研究中倫敦沙門菌對萘啶酸均敏感，但在本研究中出現耐藥性(28.9%)。

同時，倫敦沙門菌的多重耐藥率較高，對于不同宿主來源及不同環節多重耐藥率均達到90%以上，相應的多重耐藥譜較多。

不同環節分離的倫敦沙門菌中，養殖環節的耐藥率最高。人體檢樣品中的所有菌株均為多重耐藥菌，這可能是由于人類位于食物鏈的頂端，通過食物鏈、親密接觸等將耐藥性傳播給人類，這與韓國江原道發現的因農場動物感染倫敦沙門菌致最后感染嬰兒的研究報道一致[8]。

總之，耐藥性倫敦沙門菌的暴發流行及耐藥譜的擴展成為公共健康的潛在威脅，對倫敦沙門菌的耐藥性進行監測，為沙門菌的防治提供科學指導。