建立雙重熒光定量PCR方法檢測蜱傳疏螺旋體

楊小娜，張 琳，侯學霞，郝 琴

蜱是傳播多種人獸共患病病原體的重要媒介，寄主范圍廣泛，包括哺乳動物、鳥類、兩棲動物和其他脊椎動物。大多數蜱在幼蜱、若蜱、成蜱3個生長階段中通過吸食宿主血液來維持生長和發育[1]。硬蜱攜帶的病原體常可引起萊姆病、斑點熱、無形體病、埃立克體病、森林腦炎、新疆出血熱、Q熱、新型布尼亞病毒感染等疾病發生[2]。由于蜱攜帶的病原體較多，一些新的蜱傳病原體不斷發現，蜱傳疾病在全球的分布范圍不斷擴大，對家畜和人類健康造成重大危害[3]。

蜱傳疏螺旋體根據引起人類疾病的不同通常分為伯氏疏螺旋體和回歸熱螺旋體兩個分類群。伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi，BB)是引起萊姆病的病原體，萊姆病在世界70多個國家均有報道，是北美洲和歐亞大陸國家最常見的蜱傳疾病之一[4]。萊姆病可引起游走性紅斑、關節炎和其他神經系統癥狀[5]。目前，萊姆病螺旋體可分為20多個基因型，其中至少有5個能引起人類疾病，包括B.burgdorferisensustricto(B.b.s.s)、B.garinii、B.afzelii、B.bavariensis和B.spielmani[6]。Borreliamiyamotoi(BM)于1994年在日本首次分離并被確認為一種新的螺旋體。2011年，俄羅斯首次出現了人類感染病例[7]，隨后在美國、歐洲、日本也發現了病例[8-10]。從系統進化上講，它屬于回歸熱螺旋體，與大多數回歸熱螺旋體不同的是它不引起典型的回歸熱，并通過硬蜱傳播，可導致嚴重的疾病，如腦膜腦炎[11]。

在亞洲，全溝硬蜱不僅是傳播B.burgdorferi的重要媒介，而且已被證實能夠傳播B.miyamotoi，白足鼠等嚙齒動物、鳥類等也是兩種螺旋體重要的宿主[5]。至今很多研究報道了B.burgdorferi與B.miyamotoi同時感染硬蜱的病原學證據，描述了二者在同一種群的流行狀況，也發現了二者混合感染的患者[12]。兩種病原具有相同的傳播媒介(硬蜱)和宿主動物，同時人類B.miyamotoi感染有一些與萊姆病難以區分的臨床表現，如皮膚紅斑、神經系統受損癥狀等。在我國，尚未有報道利用熒光定量PCR方法用于檢測B.miyamotoi，因此，研發一種高效、快速和敏感的檢測方法用于檢測和區分這兩種病原體是非常必要的。在本研究中我們設計了一種能同時檢測這兩種病原體的雙重熒光定量PCR方法，具有良好的靈敏度和特異度，并用這種方法檢測了模擬樣本和新疆采集的200只硬蜱，對該方法進行了初步的應用評價。

1 材料與方法

1.1 材料 對照菌株DNA：鉤端螺旋體、土拉弗朗西斯菌、巴爾通體、布魯氏菌、大腸埃希菌均由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所相關科室提供。試劑與儀器：TaKaRa 熒光定量taq酶(TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye, RR390)；Roche LightCycler 480實時熒光定量PCR儀；天根DNA提取試劑(DNeasy Blood&Tissue Kit)。

1.2 方 法

1.2.1 引物探針合成 分別根據B.burgdorferirecA基因、B.miyamotoi甘油磷酸二酯酶生物合成基因(glpQ)設計引物和探針[13-14]。兩組引物探針見表1，利用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)確定其對目的基因的特異性。

表1 多重PCR引物和探針Tab.1 PCR primers and probes

1.2.2 標準品制備B.burgdorferirecA基因擴增片段為GTTCTGCAACATTAACACCTAAAGCTTTTGCATAAACAGGATCAAGAGCA-TGCTCAGCATCAATAAAAGCAGCTATCCCA-CCT(83 bp)，B.miyamotoiglpQ基因擴增片段為ATGCACGACCCAGAAATTGACACAACCACA-AATGTTGCACAATTATTTCCCAATCGAGCT-AGAGAAAACGGACGATATTACGCCACTGA-CTT(78 bp)，擴增片段交由上海生工公司合成質粒。將4 μg質粒干粉加入1 mL去離子水，得到質粒濃度4 μg/mL(4 ng/μL)。每個堿基的平均分子量660，pUC57質粒含2 710個堿基，單質粒分子量為660×(基因片段堿基數+2 710)，每μL拷貝數=(質粒濃度/單質粒分子量)×10-9×阿伏伽德羅常數。計算得到兩種質粒拷貝數均為1.3×109拷貝/μL。

1.2.3 單重熒光定量PCR

1.2.3.1 靈敏度 對熒光定量PCR反應的引物和探針濃度進行優化后，確定最佳反應體系。首先分別對recA、glpQ基因質粒進行單基因靶點的檢測，將標準質粒梯度稀釋為109～10-1拷貝/μL，每個濃度設置4個重復試驗，確保引物探針的可用性。

1.2.3.2 特異度 利用建立的單重熒光定量PCR體系，分別檢測鉤端螺旋體、布魯氏菌、土拉菌、巴爾通體、大腸埃希菌DNA。

1.2.4 雙重熒光定量PCR實驗

1.2.4.2 靈敏度 利用109～10-1拷貝/μL的陽性質粒標準品，建立20 μL反應體系，每個反應中含recA基因上下游引物和探針(10 μmol/L)分別1 μL，glpQ基因上下游引物和探針(10 μmol/L)分別0.8 μL，去離子水0.6 μL，兩種陽性質粒各2 μL。每個濃度設置4個重復實驗，4個實驗均為陽性結果則判定為陽性，確定該方法的靈敏度。

1.2.4.3 與單重熒光定量PCR方法差異性比較 根據1.2.4.2靈敏度檢測結果，將雙重與單重實驗的Ct值(熒光信號到達設定域值時所經歷的循環數)進行比較，利用配對設計資料的Wilcoxon signed -rank test 符號秩和檢驗，判斷單重與雙重檢測方法的結果有無明顯差別。

1.2.4.4 標準曲線 利用1.2.4.2的實驗數據，根據樣本濃度對數和Ct值繪制標準曲線。

1.2.4.5 特異度 利用建立的雙重熒光定量PCR體系，檢測鉤端螺旋體、布魯氏菌、土拉菌、巴爾通體、大腸埃希菌DNA。

1.2.4.6 濃度變化對檢測結果的影響 為探索使用雙重熒光定量PCR方法檢測病原體過程中，其中一種病原體在另一種病原體濃度變化背景下檢測結果的差異。設置第1組實驗：recA質粒濃度固定為104拷貝/μL，glpQ質粒濃度106～102拷貝/μL；設置第2組實驗：glpQ質粒濃度固定為104拷貝/μL，recA質粒濃度106～102拷貝/μL。如果在某一種病原體濃度變化時，另一種病原體的Ct值沒有顯著變化，說明在一種病原體濃度變化為背景時，對另外一種病原體的檢測沒有顯著影響。

1.2.4.7 探索其他病原體存在對檢測兩種病原體結果的影響 利用鉤端螺旋體、布魯氏菌、土拉菌、巴爾通體、大腸埃希菌DNA，設計如下實驗：

(1)只有recA和glpQ兩種陽性質粒。

(2)recA和glpQ兩種陽性質粒加上述5種病原體DNA，作為實驗組探索其他病原體存在對兩種病原體檢測的影響。

(3)只有上述5種病原體DNA，不含有recA和glpQ兩種陽性質粒。

(4)不含有任何病原體DNA，用去離子水補齊體系。

1.2.5 樣品檢測

1.2.5.1 模擬樣本檢測 將梯度稀釋的標準模板(107～103拷貝/μL)分別取1 μL加入9 μL檢測陰性(巢式PCR和熒光定量PCR反應均為陰性)的蜱DNA中，此時濃度變為106～102拷貝/μL，分別進行雙重熒光定量PCR反應。通過批內及批間變異系數(CV)評價反應的重現性。批內重現性：同一批次內，106～102拷貝/μL的模擬樣本分別設置3個平行樣本，分析各個稀釋度反應Ct值的變異系數。批間重現性：以不同批次間(不同時間進行3次實驗)標準模板各個稀釋度反應Ct值的變異系數評價批間重現性。

1.2.5.2 實際樣本檢測 利用本研究設計的雙重熒光定量PCR方法檢測采集于新疆200只蜱蟲B.burgdorferi和B.miyamotoi的攜帶情況。每次實驗均設計陽性對照和陰性對照進行質控。

2 結 果

2.1 單重熒光定量PCR

2.1.1 靈敏度 用優化好的反應體系做單重熒光定量PCR反應，取recA基因上下游引物探針濃度為500 nmol/L,glpQ基因上下游引物探針濃度為400 nmol/L。兩種基因能檢測到的最低濃度均為101拷貝/μL，一個反應最少能檢測20個基因拷貝。

2.1.2 特異度 利用單重熒光定量PCR體系，檢測鉤端螺旋體、布魯氏菌、土拉菌、巴爾通體、大腸埃希菌DNA。檢測結果均為陰性，說明特異性良好。

2.2 雙重熒光定量PCR

2.2.1 靈敏度 雙重熒光定量PCR方法對不同濃度梯度的標準品有很好的檢測效果，重復樣本的Ct值變化很小，重復性較好(圖1)。recA和glpQ兩種陽性質粒能檢測到的最低濃度均為102拷貝/μL，一個反應最少能檢測200個基因拷貝，與單重熒光定量PCR方法相比靈敏度下降了一個數量級。

AB A：B. burgdorferi recA基因擴增曲線；B： B. miyamotoi glpQ基因擴增曲線圖1 雙重熒光定量PCR靈敏度實驗Fig.1 Sensitivity experiments of duplex real-time PCR

2.2.2 與單重熒光定量PCR方法差異性比較 利用雙重和單重方法的Ct平均值，進行配對設計資料的Wilcoxon signed -rank test符號秩和檢驗。經檢驗，50.05，可認為兩種方法測定結果無差別(表2)。

表2 不同濃度梯度標準品測量值和期望值的比較Tab.2 Comparison of measured values and expected values

2.2.3 標準曲線B.burgdorferirecA基因和B.miyamotoiglpQ基因的濃度對數分別與檢測Ct值呈線性相關，R2分別為0.993 7、0.996 2，接近于1，擬合效果好(圖2)。

ABA：B. burgdorferi recA基因標準曲線； B：B. miyamotoi glpQ基因標準曲線圖2 雙重熒光定量PCR標準曲線Fig.2 Duplex real-time PCR standard curve

2.2.4 特異度 利用雙重熒光定量PCR體系，檢測鉤端螺旋體、布魯氏菌、土拉菌、巴爾通體、大腸埃希菌DNA。檢測結果均為陰性，說明特異性良好。

2.2.5 濃度變化影響 第1組實驗：glpQ質粒濃度變化時(106～102拷貝/μL)，recA質粒(104拷貝/μL)檢測Ct值無明顯差別；第2組實驗：recA質粒濃度變化時(106～102拷貝/μL)，glpQ質粒(104拷貝/μL)檢測Ct值無明顯差別(圖3)。說明對于這兩種疏螺旋體，其中一種病原基因濃度變化對另一種病原體檢測的結果無明顯影響。

AB圖3 一種病原濃度變化對另一種病原體檢測結果(Ct值)的影響Fig.3 Effect of concentration on detection results (Ct values)

2.2.6 其他病原體存在對檢測B.burgdorferi和B.miyamotoi結果的影響 陰性對照(3)、(4)檢測結果均為陰性，(1)、(2)BB和BM檢測均為陽性，Ct值差別不大，但是(2)的最大熒光強度比(1)低(圖4)。說明其他多種病原體DNA的存在會降低測量的熒光強度，但對于病原體的檢出沒有影響。

ABA：B. burgdorferi recA基因擴增曲線；B：B. miyamotoi glpQ基因擴增曲線圖4 其它病原體干擾實驗的基因擴增曲線Fig.4 Gene amplification curves when other pathogens interfere with the experiment

2.3 樣本檢測

2.3.1 模擬樣本檢測 通過對各濃度梯度(106～102拷貝/μL)模擬蜱樣本進行檢測，均產生陽性結果。同一批次內模擬蜱樣本各濃度Ct值的變異系數為0.111～0.406(BB)、0.675～1.301(BM)，各批次間(不同時間進行的3次試驗)各濃度Ct值的變異系數為0.412～1.238(BB)、0.285～1.149(BM)，說明反應具有較好的重現性和穩定性(圖5)。

圖5 模擬蜱樣本批內和批間變異系數Fig.5 Intra-assay and inter-assay coefficient of variation of simulated tick samples

2.3.2 實際樣本檢測 在新疆地區采集到的200只蜱中，B.burgdorferi的recA基因檢測有11個陽性(Ct值<37)，B.miyamotoi的glpQ基因檢測均為陰性。

3 討 論

B.miyamotoi與B.burgdorferi具有相同的傳播媒介和感染宿主，其感染具有相似的臨床癥狀和體征，能導致人類嚴重疾病。我國已在黑龍江省牡丹江地區和山西省祁縣地區發現了蜱感染B.miyamotoi的病原學依據，其它地區尚未有相關報道[12,15]。在我國，尚無鑒定B.miyamotoi的熒光定量PCR方法的建立。為了能同時檢測和鑒別兩種疏螺旋體，提高鑒定效率，本研究利用B.burgdorferi的recA基因和B.miyamotoi的glpQ基因，建立了一種雙重熒光定量PCR方法。

本研究首先利用兩種病原陽性質粒分別進行了單重熒光定量PCR實驗，確保每對引物和探針都能擴增出對應的病原體，同時確定反應進行的最佳引物和探針濃度。為了增強實驗結果分析的可靠性，在單重實驗的基礎上建立雙重熒光定量PCR方法，實驗結果證明兩種病原體的引物探針沒有交叉反應，對于不同濃度標準品的檢測具有良好的區分度。雙重檢測實驗靈敏度和特異度良好，標準曲線顯示Ct值與兩種病原標準品濃度的對數呈良好的線性相關關系。通過配對設計資料的Wilcoxon signed -rank test 符號秩和檢驗判定單重和雙重方法測得的Ct值結果無明顯差異。病原體濃度變化和其他病原體DNA的存在對檢測Ct值沒有明顯的影響。我們利用建立的新方法檢測模擬蜱樣本和實際蜱樣本，證明了雙重熒光定量PCR方法的可行性和實用性。

在多重檢測體系中，多對引物和探針及熒光基團之間會相互干擾，引起實驗結果靈敏度低、特異性不強的情況，我們使用了兩種方法來避免該問題。一是設計探針時使每種病原體探針的報告基團熒光發射最大波長處于不同的光譜范圍，本實驗選用的6-FAM(465-510)、VIC(533-580)兩種熒光染料，其波長處于不同光譜范圍。二是在建立雙重熒光定量PCR方法前先做了顏色補償實驗，以確保熒光定量PCR儀的檢測通道能區分每種病原體的探針，顏色補償結果用于后續結果分析。

本研究建立的雙重熒光定量PCR方法能快速檢測蜱樣本中B.burgdorferi和B.miyamotoi，但是能否用于臨床標本的檢測或者人類疾病的診斷分析還需要進一步的研究。該方法快速、靈敏、特異，為我們提供了一個有價值的檢測工具，可用于病媒檢測和風險評估，為疾病控制及生物安全提供了技術支持，也為臨床檢測提供了思路。