基于核酸預混室溫儲運技術的熒光定量PCR快速檢測鼠疫耶爾森氏菌

謝 輝，周 蕾，祁芝珍，邵高祥

鼠疫是由鼠疫菌感染所引起的一種自然疫源性疾病，能通過呼吸道直接接觸傳播，引起人間疫情暴發流行。快速有效的診斷技術是控制鼠疫疫情的關鍵，鼠疫菌傳統診斷方法主要有細菌培養及鼠疫反向血凝試驗，在鼠疫監測和疫源地調查中使用頻率高，特異性較強，但操作復雜且耗時，易延誤疫情判定。本研究是基于核酸預混室溫儲運技術的熒光定量PCR診斷方法，首先是建立熒光定量PCR(探針)診斷方法以快速準確檢測鼠疫菌，其次將熒光定量PCR檢測試劑(引物、酶、dNTP)預混凍干，徹底擺脫冷鏈運輸和冷藏保存，從而制備一種能夠在室溫(25 ℃)穩定保存的試劑，使用時僅需將待測核酸溶液與預混試劑簡單混合(試劑可瞬間崩解)即可上機檢測，大大簡化了操作流程，降低了外源污染的可能性。這種基于室溫長期儲存的核酸檢測預混體系的熒光定量PCR檢測方法，適合鼠疫疫源地監測以及流行病學現場調查，為鼠疫的預防和控制提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑及儀器 核酸檢測試劑(探針法)由北京磐創精準有限公司提供；中國細菌濁度標準管(批號2020-1)由中國藥品生物制品檢定所提供；熒光定量 PCR擴增儀購于鯤鵬基因(北京)科技有限責任公司。

1.1.2 實驗菌株 測試菌株：55株鼠疫耶爾森菌菌株是分別從11個鼠疫自然疫源地不同宿主動物分離獲得的代表株；減毒菌株EV76由鼠疫菌專業實驗室提供。對照菌株：假結核耶爾森氏菌15種血清型，由鼠疫菌專業實驗室提供。見表1。

表1 熒光定量PCR凍干試劑檢測試驗菌株的結果Tab.1 Detection of the test strain with fluorescence quantitative PCR lyophilized reagent

1.2 方 法

1.2.1 菌株培養及模板制備 將選取的55株野生鼠疫耶爾森氏菌菌株、減毒菌株EV76及15種血清型假結核耶爾森氏菌培養于1%溶血赫氏培養基，經28 ℃孵育24 h，取細菌培養物加入0.5 mL滅菌純水制成菌懸液， 100 ℃加熱10 min滅活后離心(12 000 r/min，2 min)，取上清作為DNA模板，其中減毒菌株EV76模板作為陽性質控模板。

1.2.2 熒光定量PCR檢測法

1.2.2.1 引物的設計與合成 引物合成根據NCBI數據庫(GenBank登錄號AF350075)公布的鼠疫耶爾森菌3a基因序列，由北京磐創精準有限公司合成：

Y3a1：5′-TGTAGCCGCTAAGCACTACCATCC-3′；

Y3a2：5′-GGCAACAGCTCAACACCTTTGG-3′。

1.2.2.2 鼠疫菌模板的制備 參照1.2.1取上清作為DNA模板。

1.2.2.3 基于核酸預混室溫儲運技術熒光定量擴增反應的優化 以不同退火溫度(60～65 ℃)進行熒光定量擴增反應，選擇最佳退火溫度。

1.2.2.4 基于核酸預混室溫儲運技術的熒光定量PCR檢測方法 反應體系及擴增和循環條件：反應體系20 μL，取制備的各菌株模板19 μL加入凍干試劑(1 μL)進行溶解，同時用EV菌模板作為陽性對照，用滅菌去離子水作為陰性對照，用優化擴增條件進行熒光定量PCR擴增：42 ℃ 1 min，95 ℃預變性5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃退火延伸30 s，45個循環；40 ℃保溫 60 s，結束后進行熒光信號采集，根據熒光信號循環(Ct)來判斷擴增結果，Ct值<35判為陽性。

靈敏度試驗：根據比濁法測定鼠疫耶爾森菌EV76菌液濃度，將菌液從106CFU/mL以10倍倍比稀釋至1.0×102CFU/mL，取各濃度菌液制備模板(方法同1.2.1)用于熒光定量PCR擴增。

特異性試驗：將制備的55株野生鼠疫菌菌株模板、假結核耶爾森氏菌15種血清型進行熒光定量擴增，驗證其特異性。

凍干試劑的保存期試驗：將試劑分別放置于25 ℃、37 ℃，保存不同時間，定期進行敏感性檢測，考察不同時間、溫度條件下該試劑的穩定性。

2 結 果

2.1 基于核酸預混室溫儲運技術的熒光定量PCR退火溫度的優化結果 以鼠疫EV菌為模板，在不同退火時間、不同退火溫度下的試驗結果顯示，反應條件退火溫度為60 ℃時，對EV菌株的檢測信號值最強，Ct值最小。

2.2 基于核酸預混室溫儲運技術的熒光定量PCR標準曲線的構建 以鼠疫耶爾森氏菌EV為熒光定量PCR反應標準品，以比濁法測定菌液濃度稀釋至1×106CFU/mL，再以滅菌純水10倍稀釋至1×10 CFU/mL，取各濃度菌液提取核酸進行熒光定量PCR檢測，檢測所得各個標準品的Ct值，熒光定量PCR儀自動生成標準曲線，見圖1所示。

圖1 鼠疫耶爾森氏菌核酸預混凍干試劑檢測標準曲線Fig.1 Standard curve of Yersinia pestis detection with nucleic acid premix lyophilized reagent

2.3 基于核酸預混室溫儲運技術的熒光定量PCR敏感性檢測 通過對鼠疫菌懸液10倍系列稀釋后制備模板，按照1.2.2進行熒光定量檢測，結果顯示基于核酸預混室溫儲運技術的熒光定量PCR敏感性達到102CFU/mL，如圖2所示。

2.4 基于核酸預混室溫儲運技術的熒光定量PCR特異性檢測 將提取的我國11個疫源地野生鼠疫耶爾森菌55株作為模板進行熒光定量PCR擴增，結果顯示，55株野生鼠疫菌檢測為陽性，與鼠疫菌近源的假結核耶爾森菌15種血清型檢測為陰性(圖3)，說明研制的核酸預混凍干試劑具有較好的特異性。

a～k為我國11塊疫源地野生鼠疫菌代表菌株的擴增曲線；l為假結核耶爾森菌代表菌株；m為陰性對照圖3 鼠疫耶爾森氏菌核酸預混凍干試劑特異性試驗Fig.3 Specificity test of Yersinia pestis detection with nucleic acid premix lyophilized reagent

2.5 基于核酸預混室溫儲運技術的熒光定量PCR檢測凍干試劑的保存期試驗 結果顯示核酸預混凍干試劑置于25 ℃、37 ℃保存180 d后檢測其敏感性，與對照溫度(0 ℃)相比無差異，檢測下限均為1×102CFU/mL。見表2。

表2 熒光定量PCR凍干試劑不同保存條件的敏感性(Ct值)Tab.2 Sensitivity of the fluorescence quantitative PCR lyophilized reagent under different preservation conditions (Ct value)

3 討 論

我國是鼠疫自然疫源地分布廣泛、結構高度復雜的國家，到目前為止已有11塊鼠疫疫源地[1]，為防止鼠疫從疫源地向人類傳播，我國針對鼠疫疫源地采取多種監測措施[2]，而能夠提高監測效力的措施，防止疫源地動物疫情波及人間，最關鍵技術環節就是建立實用性鼠疫菌檢測的實驗室診斷方法。目前在鼠疫疫源地監測主要依靠細菌培養及鼠疫反向血凝試驗，這些方法在過去幾十年里為鼠疫菌診斷發揮了重大作用，但因其敏感性差、檢測時間滯后不能滿足快速診斷的需要[3]。現行的鼠疫診斷標準[4]將聚合酶鏈式反應(PCR)納入其中，大大促進了鼠疫菌檢測技術的發展，但存在操作步驟復雜、易引起核酸污染而出現假陽性、無法定量分析等不足，尤其是鼠疫疫源地在偏遠地區而PCR試劑的運輸、儲存及現場應用均在低溫條件下進行，導致檢測鼠疫菌PCR技術不能較好發揮作用。為解決實際問題，1995年出現的針對PCR實際應用需要室溫保存試劑的研究[5-6]，因能克服上述缺點，已有學者將其應用于病原體檢測[7]。本項目是在上述研究成果上通過依托經典、可靠的熒光定量PCR技術為基礎，將全體系預混室溫儲存技術應用于野外監測時鼠疫菌的檢測。

基于全體系預混室溫儲存技術熒光定量PCR方法的工作原理，是將熒光定量PCR反應體系中的酶、引物、探針、dNTP預先混合后進行引物探針優化設計，加入既能保護核酸試劑的活性又可為試劑復溶提供賦形與崩解的穩定劑，通過采用熱干燥、冷凍干燥等不同干燥工藝和不同工藝參數分別對支撐體系進行干燥，研制成全預混體系可室溫儲存的凍干試劑。本研究正是應用已研制的凍干檢測試劑，只需加入樣品模板，置于熒光定量PCR分析儀檢測鼠疫菌，通過分析軟件直觀記錄整個PCR過程，一步式加樣使操作過程簡便化，避免核酸污染和操作時的人為誤差。為考察該技術是否適合檢測我國各鼠疫疫源地菌株，本試驗選取我國11塊鼠疫疫源地55株野生菌代表菌株及與鼠疫菌近源的耶爾森氏菌屬中的假結核耶爾森氏菌15種血清型，進行熒光定量PCR擴增。實驗結果顯示，基于全體系預混室溫儲存技術的熒光定量PCR凍干試劑的敏感性為102CFU/mL，這與文獻報道的普通PCR(敏感性為102CFU /mL)相同[8]。特異性結果表明我國11個疫源地的野生鼠疫菌擴增均為陽性，假結核耶爾森菌15種血清型擴增均為陰性，驗證該技術具有良好特異性。凍干試劑在25 ℃(室溫)以及37 ℃(高溫)條件下保存180 d，敏感性與冷凍保存的試劑無差異，利用標準曲線可得出鼠疫耶爾森氏菌定量結果。

本研究對該檢測方法的應用進行了初步研究，首次應用本檢測方法檢測我國各疫源地的鼠疫耶爾森氏菌，該方法具有敏感性高、特異性強、可量化的特點，為研制診斷試劑盒奠定了基礎；全預混的凍干試劑可室溫儲存、運輸，試驗操作便捷快速，實現了實驗室精準技術在鼠疫野外現場條件下的廣泛使用。