基于TCGA數據庫的胃癌預后miRNAs篩選及預后評估模型構建

代孟祝 (四川大學華西廣安醫院消化內科，四川 廣安 638500)

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤。我國是胃癌高發國家，據統計2015年我國胃癌發病人數僅次于肺癌，同時胃癌相關死亡人數在所有惡性腫瘤中高居第三位，且胃癌的發病率仍呈現上升趨勢[1]。近年來，隨著診斷和治療技術的發展，我國胃癌早期發現率顯著提高，預后有明顯改善，且晚期胃癌的預后仍較差，5年生存率不到10%[2-4]。小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為18～25堿基的短鏈非編碼RNA，盡管miRNA不編碼蛋白，但成熟的miRNA可以與mRNA的3′UTR區結合，在轉錄后水平抑制靶基因的表達，研究表明miRNA表達異常與癌癥發生發展相關[5]，因此miRNA具有潛在的診斷和預測價值。基于miRNA表達譜的系統性標志物篩選對胃癌發病機理、治療靶點開發和預后評估具有重要意義。目前關于胃癌預后miRNA的系統性研究較少，本研究基于癌癥基因圖譜數據庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中公開的胃癌miRNA表達數據，提取臨床信息，利用Cox回歸分析篩選胃癌預后相關miRNAs，并構建預后風險評分模型，同時對預后miRNA進行功能分析，揭示miRNA在胃癌中的調控作用和預后風險評估中的應用價值。

1 資料與方法

1.1數據下載與處理：利用R(version 4.0.0)中RTCGA包下載TCGA數據庫中胃腺癌(Stomach adenocarcinoma，STAD)的miRNA數據，提取RNA表達矩陣和患者臨床資料，該數據包括41例正常組織樣本和436例胃癌樣本。對提取的表達矩陣依次過濾0值和低表達miRNA，去除正常組織樣本和臨床信息不完整的胃癌樣本，最后對表達數據進行標準化和Log2轉換，獲得389個胃癌樣本的618個miRNA表達矩陣用于后續分析。本研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2Cox回歸分析構建STAD預后風險模型：利用R中的Survival包對618個miRNA依次進行單變量Cox回歸分析，根據P<0.05篩選與預后相關的miRNA。利用R中的Survival包對預后相關的miRNA進行Cox 多變量回歸分析，構建比例風險模型，計算風險評分(Risk Score)，根據風險評分中位數將患者劃分為高風險組和低風險組，并繪制生存曲線(Kaplan-Meier法，KM曲線)和受試者工作特征(ROC)曲線，評估模型預測效果。

1.3miRNA靶基因功能分析：利用在線預測工具miRWalk (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)對STAD預后相關的miRNA進行靶基因預測[6]，min P-value為>0.95，結合區域為3′ UTR，輸出與TargetScan數據庫共有的靶基因，利用R包對靶基因進行KEGG信號通路富集分析。

2 結果

2.1STAD預后miRNA篩選及風險評分模型：通過單變量Cox回歸分析共篩選到33個STAD預后相關的miRNA(P<0.05)，將篩選到的33個miRNA進行多變量Cox回歸分析確定最優模型，得到14-miRNA的STAD預后風險評估模型。根據β>0且HR>1表明hsa-mir-184、hsa-mir-7-1、hsa-mir-541、hsa-mir-597、hsa-mir-676和hsa-mir-3143等miRNA為胃癌預后風險因素，根據β<0且HR<1表明hsa-mir-3648、hsa-mir-7-2、hsa-mir-362、hsa-mir-3161、hsa-mir-3610和hsa-mir-320c-2等miRNA為STAD預后保護因素。見表1。

表1 Cox回歸分析結果

根據構建風險評分模型，對所有患者計算Risk Score，根據Risk Score將患者分為高風險組和低風險組進行生存分析，繪制KM曲線見圖1，結果顯示高風險組與低風險組預后差異有統計學意義(P<0.01)；同時繪制ROC曲線見圖2，結果顯示AUC面積為0.793，提示模型具有較好的預測效果。

圖1 基于14-miRNA風險評分的胃腺癌患者KM生存曲線

圖2 14-miRNA預后預測模型ROC曲線

2.2胃癌預后相關miRNA靶基因功能分析：對14個胃癌預后miRNA利用miRWalk在線分析工具進行靶基因預測，預測靶基因共355個基因，對靶基因進行細胞信號通路富集分析，結果顯示主要信號通路為：細胞衰老、膠質瘤、非小細胞肺癌、人巨細胞病毒感染、孕酮介導的卵母細胞成熟、cAMP信號通路、破骨細胞分化、FoxO信號通路、黑色素瘤和乙型肝炎等信號通路。見圖3。

圖3 預后miRNA靶基因信號通路富集分析

3 討論

研究表明miRNA參與調控癌細胞的增殖、分化、遷移和侵襲等生物學過程，miRNA可以抑制癌基因或抑癌基因的表達，miRNA通常調控1個或多個靶基因而形成復雜的調控網絡，在癌癥的發生發展中扮演重要角色[6]。近年來，大量研究報道了胃癌相關miRNA標志物及相關機理，如Zhu等發現miR-6165在胃癌組織中低表達，靶向調控STRN4表達上調進而促進胃癌細胞遷移和侵襲[7]。又如Ting等報道發現，胃癌來源的外泌體中miR-155可以抑制靶基因c-MYB表達同時上調VEGF表達，促進胃癌增殖、轉移和血管生成[8]。此外Bie等發現晚期胃癌患者血清中miR-191和miR-425是FOLFOX化療敏感性獨立預測因子[9]。這些研究表明miRNA參與胃癌細胞增殖、分化、轉移和耐藥等一系列過程，是胃癌潛在的預后因子。

本研究基于TCGA數據庫篩選與胃腺癌預后相關的miRNA，利用Cox回歸分析構建了基于14-miRNA的胃腺癌預后風險評分模型，AUC面積為0.793，表明該模型的預后預測效果較好。本研究篩選到hsa-mir-184、hsa-mir-7-1、hsa-mir-541、hsa-mir-597、hsa-mir-676、hsa-mir-3143、hsa-mir-450a-1和hsa-mir-1911等胃癌預后風險因素，其中hsa-mir-184在乳腺癌[10]、腎癌[11]、膠質瘤[12]和肝細胞癌[13]等多種癌癥中高表達，通過上調c-Myc、SND1等基因表達促進細胞增殖和轉移；先前的研究發現hsa-mir-184在胃癌中高表達且與胃腺癌的預后不良相關[14]，與本研究結果一致，但分子機制仍不明確；研究發現miR-7-1是多種癌癥中的抑癌因子，抑制miR-7-1生成可以激活其靶基因如EGF受體蛋白表達，進而促進肝癌細胞增殖[15]。相反，本研究結果提示miR-7-1可能是促癌因素，其在胃癌中的作用仍需進一步探究；另有研究表明，hsa-mir-541可以通過調控TMPRSS4表達抑制肝癌細胞轉移和EMT[16]，但本研究表明hsa-mir-541可能具有促癌作用。此外，本研究結果表明hsa-mir-3648、hsa-mir-7-2、hsa-mir-362、hsa-mir-3161、hsa-mir-3610和hsa-mir-320c-2等miRNA為潛在的抑癌因子。研究發現hsa-mir-3648可以靶向TCF21基因促進膽管癌增殖[17]，hsa-mir-362與多種癌癥相關。Wei 等采用miRNA芯片篩選順鉑敏感的人胃癌細胞株SGC7901與相應的順鉑耐藥細胞株SGC7901/DDP之間差異miRNA發現，hsa-mir-362在SGC7901/DDP細胞中低表達，進一步研究發現miR-362-5p通過靶向SUZ12增加順鉑敏感性，促進細胞凋亡，提示miR-362-5p是抑癌因子[18]。miRNA與靶基因作用是復雜的，可能通過1個或多個miRNA調控1個或多個靶基因，從而形成復雜的調控網絡，基于生物信息學手段結合數據庫的大樣本量分析可以更系統地展示miRNA與癌癥發生發展的關系，及其調控的潛在信號機制。本研究中對miRNA靶基因的KEGG富集分析得到多種癌癥相關信號通路，如細胞衰老、膠質瘤、非小細胞肺癌、cAMP信號通路、FoxO信號通路、黑色素瘤、肝癌、VEGF信號通路、胃癌和mTOR信號通路，其中FoxO、VEGF和mTOR等信號均為腫瘤細胞增殖和轉移相關信號通路[10-21]。此外還有脂質和膽汁酸相關代謝通路，表明這些miRNA可能通過影響胃癌細胞增殖信號進而影響預后，具體分子機制有待進一步研究。

綜上所述，基于大樣本量數據篩選胃癌預后miRNA并預后評估模型具有潛在的臨床應用價值，胃癌預后相關miRNA通過多種機制參與胃癌調控，相關機制有待進一步探究與驗證。