miR-193a-3p通過LGR4/ATF4信號的上調(diào)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化

馬偉杰，白金喜，李江平，王 斌 (.廣州市南沙區(qū)中醫(yī)醫(yī)院外二科，廣東 廣州 546；.佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣東 佛山 5800)

骨重塑主要受成骨細(xì)胞代謝和破骨細(xì)胞代謝之間的平衡控制[1]。成骨細(xì)胞是指在調(diào)節(jié)產(chǎn)后骨形成中起重要作用的成骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞是骨基質(zhì)中溶解無機(jī)成分的吸收細(xì)胞。成骨細(xì)胞通過產(chǎn)生骨基質(zhì)蛋白和堿性磷酸酶(ALP)促進(jìn)骨形成，誘導(dǎo)骨基質(zhì)礦化。成骨細(xì)胞分化是由各種生長因子和激素觸發(fā)的，這些因子和激素有助于骨骼發(fā)育和改善骨骼發(fā)育[2]。因此，試圖改善成骨細(xì)胞分化是一種潛在的、有前途的治療骨損傷和骨丟失策略，如防治骨質(zhì)疏松癥或骨折。

microRNA(miRNA)是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。據(jù)報(bào)道，miRNAs參與了各種生物反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、凋亡和分化[3]。miRNAs在成骨細(xì)胞分化和骨形成中起著重要的協(xié)調(diào)作用。然而，miRNAs在成骨細(xì)胞分化中的精確調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不清楚。有研究在成骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)過程中，miR-193a-3p的表達(dá)發(fā)生了改變影響成骨細(xì)胞分化過程，誘導(dǎo)mRNA的降解和翻譯抑制[4]。

LGR4又稱G蛋白偶聯(lián)受體48，是G蛋白偶聯(lián)受體的成員[5]，在各種生理功能中起著至關(guān)重要的作用。越來越多的研究表明，LGR4在調(diào)節(jié)骨形成和重塑中起著重要作用。研究表明，LGR4促進(jìn)成骨細(xì)胞分化同時(shí)抑制破骨細(xì)胞分化[6]。因此，LGR4是骨形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是改善骨疾病的一個(gè)有用的靶點(diǎn)。

近年來，miR-193a-3p由于其在各種生物過程中的重要作用而得到了廣泛的研究。 先前的一項(xiàng)研究報(bào)道，在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化過程中，miR-193a-3p的表達(dá)發(fā)生了改變[7]。 然而，miR-193a-3p在成骨細(xì)胞分化過程中的作用靶點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討miR-193a-3p在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化中的確切靶點(diǎn)及其機(jī)制。

研究方案按照1964年赫爾辛斯基宣言有關(guān)規(guī)定，經(jīng)由佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院和廣州市南沙區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審查通過。選取兩院2019年7月～2021年1月收治的骨質(zhì)疏松患者20例?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)和成骨細(xì)胞分化：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞模型(hBMSCs)由髂前上棘骨穿刺術(shù)取骨質(zhì)疏松患者骨髓組織，在DMEM-F12(Gibco，美國)中培養(yǎng)，添加10%胎牛血清(TaKaRa，中國)，2 mm L -谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素混合。293T細(xì)胞由中國科學(xué)院干細(xì)胞庫(上海)提供，在DMEM(Gibco，美國)中培養(yǎng)，補(bǔ)充10%FBS和1%青霉素-鏈霉素混合物。 細(xì)胞維持37℃時(shí)，含有5%CO2和95%的空氣。為了誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，將BMSCs培養(yǎng)在含有100 nm地塞米松、10 mMb-甘油磷酸和50 mM抗壞血酸的成骨分化培養(yǎng)基中。每2天更新一次。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染:Agomi R-193a-3p、antagomi R-193a-3p及其陰性對照從基因公司(TaKaRa，中國)購買，并根據(jù)制造商的協(xié)議，使用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(賽默飛公司，美國)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。LGR4和ATF4 shRNA Lentiviral顆粒(賽默飛公司，美國)按照Manu-facturer的指示轉(zhuǎn)化為細(xì)胞。

1.3RNA提取與實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR):總RNA的提取使用TRIZOL試劑(鐸洋生物有限公司，廣州)遵循制造商的協(xié)議。為了檢測miRNA，使用TaqMan微RNA反向轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，中國)進(jìn)行cDNA合成，并使用TaqMan微RNA檢測試劑盒(TaKaRa，中國)進(jìn)行RT-qP CR進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。對于mRNA的檢測，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa，中國)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并使用Power SYBR Green PCR Master Mix(鐸洋生物有限公司，廣州)進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行mRNA表達(dá)正?；?。比較用2-ΔΔCT方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并將其表示為與對照相比的變化。

1.4ALP活性的測定:用ALP測定試劑盒(伯樂公司，美國)測定活性。細(xì)胞被俘獲后，用裂解緩沖液溶解。離心后收集上清液，然后轉(zhuǎn)移到96孔板中。然后，將上清液與對硝基苯磷酸酯(PNPP)和反應(yīng)緩沖液在37°C下孵育10 min，最后使用酶標(biāo)儀在570 nm下測試了吸光度值(OD值)。

1.5基質(zhì)礦化的檢測:采用茜素紅(ARS)(伯樂公司，美國)染色法測定基質(zhì)礦化。細(xì)胞用PBS洗滌，然后，用4%甲醛固定細(xì)胞1 h，室溫下用40 mM ARS溶解(伯樂公司，美國)孵育15 min。用蒸餾水洗滌細(xì)胞，除去未結(jié)合的染料分子，在37℃下溶解10%十六烷基吡啶氯化銨30 min，檢測540 nm處的OD值。

1.6雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn):用PCR擴(kuò)增含有miR-193a-3p結(jié)合序列的小鼠LGR4 3′-UTR，并將其插入pmirGLO報(bào)告載體(Promega，美國)。結(jié)合區(qū)域突變在LRG43′-UTR是產(chǎn)生的一種快速改變定向突變試劑盒(Stratagene，美國)。用LipofectamineRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(伯樂公司，美國)將構(gòu)建的pmirGLO-LGR4 3′-UTR載體與AgomiR-193a-3p共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。在孵育48 h后，用雙熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)(Promega，美國)測量熒光素酶活性。用光度計(jì)檢測熒光素酶活性，將螢火蟲熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為Renilla熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1miR-193a-3p在成骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)下調(diào):為了探討miR-193a-3p在成骨細(xì)胞分化中的潛在作用，我們研究了miR-193a-3p在成骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化。培養(yǎng)BMSCs誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，在第1天、第7天和第14天測定miR-193a-3p的表達(dá)水平。結(jié)果表明，miR-193a-3p的表達(dá)水平在成骨細(xì)胞分化過程中，以時(shí)間依賴性的方式顯著下調(diào)(見圖1)。結(jié)果表明，miR-193a-3p可能在成骨細(xì)胞分化中起重要作用。

圖1 miR-193a-3p在成骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)水平

2.2miR-193a-3p調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化:為了研究miR-193a-3p是否調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化，我們分別通過轉(zhuǎn)染AgomiR-193a-3p和AntagomiR-193a-3p在BMSCs中進(jìn)行了過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染AgomiR-193a-3p的BMSCs水平上調(diào)，而轉(zhuǎn)染AntagomiR-193a-3p的BMSCs水平下調(diào)。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染AgomiR-193a-3p和AntagomiR-193a-3p在BMSCs中過表達(dá)

為了研究miR-193a-3p的精確生物學(xué)功能，我們檢測了miR-193a-3p對ALP活性和基質(zhì)礦化的影響。結(jié)果表明，miR-193a-3p的過表達(dá)下調(diào)了BMSCs的ALP活性，抑制了BMSCs的基質(zhì)礦化。見圖3。

圖3 miR-193a-3p對ALP活性和基質(zhì)礦化的影響

評估m(xù)iR-193a-3p對成骨細(xì)胞標(biāo)記基因Runx2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，miR-193a-3p的過表達(dá)則下調(diào)Runx2的表達(dá)。見圖4。

圖4 miR-193a-3p的過表達(dá)時(shí)Runx2的表達(dá)

2.3確定LGR4為miR-193a-3p的靶基因:為了闡明miR-193a-3p調(diào)控成骨細(xì)胞分化的潛在機(jī)制，我們利用生物信息學(xué)分析方法尋找了miR-193a-3p的候選靶基因。我們發(fā)現(xiàn)LGR4是骨形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，被預(yù)測為miR-193a-3p的潛在靶基因。LGR4mRNA的3′-UTR對miR-193a-3p具有保守的結(jié)合位點(diǎn)。見圖5。

為了驗(yàn)證miR-193a-3p是否直接針對LGR4，我們構(gòu)建了含有野生型(WT)或突變型(MT)結(jié)合位點(diǎn)的LGR4 3′-UTR的熒光素酶記者。熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)表明，miR-193a-3p的過表達(dá)顯著降低了含有WT結(jié)合位點(diǎn)的LGR4 3′-UTR熒光素酶報(bào)告者的熒光素酶活性。然而，miR-193a-3p的過表達(dá)對含有miR-193a-3pMT結(jié)合位點(diǎn)的LGR43′-UTR熒光素酶沒有明顯影響。見圖6。

圖6 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)miR-193a-3p的過表達(dá)對WT、MT結(jié)合位點(diǎn)的LGR43′-UTR

檢測miR-193a-3p對LGR4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p的過表達(dá)顯著下調(diào)LGR4的表達(dá)。見圖7。

圖7 檢測miR-193a-3p對LGR4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

綜上所述，這些結(jié)果表明miR-193a-3p直接與LGR4 3′-UTR結(jié)合，并負(fù)調(diào)控LGR4的表達(dá)。

2.4miR-193a-3p通過LGR4調(diào)節(jié)ATF4的表達(dá):為了進(jìn)一步研究miR-193a-3p在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化中的分子基礎(chǔ)，我們檢測了miR-193a-3p對調(diào)節(jié)骨信息的LRG4下游靶點(diǎn)ATF4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示miR-193a-3p的過表達(dá)顯著降低了ATF4的表達(dá)，而miR-193a-3p的抑制促進(jìn)了ATF4的表達(dá)。見圖8。

圖8 miR-193a-3p對調(diào)節(jié)骨信息的LRG4下游靶點(diǎn)ATF4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

3 討論

miR-193a-3p是一種重要的調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的因子，據(jù)報(bào)道，miR-193a-3p在各種細(xì)胞過程中起著重要作用[8]。miR-193a-3p參與各種細(xì)胞的細(xì)胞分化。miR-193a-3p被報(bào)道用于調(diào)節(jié)髓系前體的分化，在急性髓系白血病中起著重要作用[9]。然而，miR-193a-3p是否參與成骨細(xì)胞分化尚不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化過程中明顯下調(diào)。miR-193a-3p是人脂肪源干細(xì)胞[10]成骨細(xì)胞分化過程中下調(diào)的miRNAs之一。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)抑制miR-193a-3p促進(jìn)了BMSCs的成骨細(xì)胞分化，而miR-193a-3p的過度表達(dá)則抑制了BMSCs的成骨細(xì)胞分化，表明miR-193a-3p在成骨細(xì)胞分化中起著重要作用。最近的一項(xiàng)研究報(bào)告miR-193a-3p通過靶向高遷移率組蛋白1抑制BMSCs成骨細(xì)胞分化[11]，提示miR-193a-3p在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化具有明顯的機(jī)制性。以上支持miR-193a-3p通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化在骨形成中的重要作用。LGR4已成為骨形成的重要調(diào)節(jié)因子。 LGR4基因敲除小鼠成骨細(xì)胞分化受損。LGR4的表達(dá)受骨形態(tài)基因蛋白2的調(diào)控，該蛋白能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞在體外中的分化。研究表明，LGR4通過環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A通路激活A(yù)TF4的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成[4]。LGR4介導(dǎo)的Wnt/b-catenin信號通路也有助于促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。LGR4已被鑒定為R-海綿蛋白2的受體，通過激活Wnt/b-catenin信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[12]。阻斷LGR4可阻礙干細(xì)胞分化，并干擾Wnt/β-catenin信號。除了調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的差異，LGR4還調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化。研究表明，LGR4結(jié)合RANKL在體外和體內(nèi)抑制破骨細(xì)胞分化[13]。下調(diào)LGR4參與誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化，通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和破骨細(xì)胞分化來重塑。在本研究中，我們確定LGR4為miR-193a-3p的靶基因。我們發(fā)現(xiàn)抑制miR-193a-3p上調(diào)LGR4表達(dá)，這有助于促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。此外，我們還闡明了miR-193a-3p抑制誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化與ATF4表達(dá)的上調(diào)有關(guān)，證實(shí)了LGR4/ATF4信號在成骨細(xì)胞分化中的重要性。ATF4是通過誘導(dǎo)骨鈣素、骨唾液蛋白和膠原的表達(dá)來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，有助于骨形成[14]。 因此，我們的研究提示了調(diào)節(jié)LGR4/ATF4信號的潛在靶點(diǎn)，并強(qiáng)調(diào)了miR-193a-3p/LGR4/ATF4軸在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化中的重要作用?？傊?，我們的結(jié)果表明，抑制miR-193a-3p通過上調(diào)LGR4/ATF4信號促進(jìn)BMSCs成骨細(xì)胞分化，靶向miR-193a-3p激活LGR4/ATF4信號可能是改善骨形成和防止骨質(zhì)疏松等骨疾病中一種有用的方法。