NTS/NTSR1在膽管細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中作用及機(jī)制研究

黃奕森，蘇子劍，張劍華，潘劍輝，劉小瑜 (.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院消化內(nèi)科，福建 泉州 36000；.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院肝膽外科，福建 泉州 36000)

神經(jīng)降壓素(NTS)是一個(gè)含有13個(gè)氨基酸的神經(jīng)肽[1]， NTS廣泛表達(dá)在人類和動(dòng)物的大腦和胃腸道中。已有研究表明，NTS可以為多種類型上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤提供一種生長(zhǎng)信號(hào)促進(jìn)腫瘤的增殖，包括結(jié)腸癌乳腺癌[2-3]、肺癌[4]、胰腺癌[5]、前列腺癌[6]。NTS的作用由三種類型的NTS受體介導(dǎo) (NTSRs)，包括高親和力受體NTSR1和NTSR2，低親和力受體NTSR3[7]。NTS高親和力受體 NTSR1參與介導(dǎo)了NTS 的生理及病理作用。研究發(fā)現(xiàn) NTS /NTSR1信號(hào)的異常與人類多種惡性腫瘤(如結(jié)腸癌[8]、前列腺癌[9]、惡性B淋巴細(xì)胞瘤[10]等)的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，旨在通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)確定NTSR1在膽管癌增殖浸潤轉(zhuǎn)移中的作用，初步探明NTS/NTSR1在膽管癌的增殖轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料及試劑:細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑MTS購自promega(G3581),Anti-Neurotensin Receptor 1/NTSR1 antibody (ab117592) ，Anti-ERK1 + ERK2 (phospho T202 + Y204) antibody [SP327] (ab223500)、Anti-p38 (phospho T180 + Y182) antibody (ab4822)、Recombinant Anti-JNK1 + JNK2 + JNK3 (phospho T183+T183+T221) antibody [EPR5693] (ab124956)及Anti-PKC alpha (phospho S657 + Y658) antibody (ab23513)和Anti-GAPDH antibody [mAbcam 9484]均購自ABCAM。試驗(yàn)用培養(yǎng)基及血清均購自Gibco公司,實(shí)驗(yàn)中耗材均購自GreinerBioOne。

1.2NTSR1特異性拮抗劑SR48692對(duì)人膽管細(xì)胞癌細(xì)胞HUCCT1-1增殖遷移影響:用MTS方法檢測(cè)加入不同濃度5 μmol/L和10 μmol/L特異性拮抗劑SR48692后24 hr，48 hr，72 hr細(xì)胞增殖能力。通過transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加入不同濃度5 μmol/L和10 μmol/L特異性拮抗劑SR48692后細(xì)胞遷移能力變化。

1.3篩選膽管癌細(xì)胞并進(jìn)行改造：培養(yǎng)并收取相同數(shù)量的RBE、HUCCT1、HCCC 9810、 CCLP-1四株膽管癌細(xì)胞，用RIPA的方法提取蛋白質(zhì)，用WESTERN BLOT的方法檢測(cè)RBE、HUCCT1、HCCC 9810、 CCLP-1四株膽管癌細(xì)胞中NTSR1的表達(dá)差異，根據(jù)結(jié)果選出較高表達(dá)量的細(xì)胞株HUCCT1進(jìn)行改造。 用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建過表達(dá)NTSR1的細(xì)胞株HUCCT1-NTSR1和敲減NTSR1的細(xì)胞株HUCCT1-siNTSR1，WESTERN BLOT方法檢測(cè)改造后細(xì)胞NTSR1的表達(dá)差異，體外通過MTS的方法檢測(cè)改造后細(xì)胞株的增殖能力，用transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力。在體內(nèi)通過成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。

1.4NTSR1分子與MAPK通路中的關(guān)鍵靶標(biāo)分子相關(guān)性檢測(cè):用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)改造前后膽管癌細(xì)胞HUCCT1中NTSR1和MAPK通路三個(gè)關(guān)鍵活性分子ERK1/2、P38MAPK、JNK及顯著差異表達(dá)基因PKC的蛋白磷酸化水平。進(jìn)一步試驗(yàn)檢測(cè)在過表達(dá)NTSR1膽管癌細(xì)胞細(xì)胞系中應(yīng)用P38MAPK特異性抑制SB203580、ERK1/2特異性抑制劑U0126和JNK特異性抑制劑SP600125通道抑制劑后細(xì)胞增殖/侵襲/凋亡能力的變化。

2 結(jié)果

2.1NTSR1特異性拮抗劑SR48692對(duì)四株人膽管細(xì)胞癌細(xì)胞增殖遷移檢測(cè)結(jié)果:通過MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖率， 檢測(cè)結(jié)果如圖1A所示：未給藥組細(xì)胞增殖最快，以HUCCT1細(xì)胞為例，到第3天時(shí)細(xì)胞吸光值為0.83，是第一天吸光值0.156的5.32倍；給藥濃度10 μmol/L細(xì)胞增殖最慢，到第3天時(shí)細(xì)胞吸光值為0.408，是第一天吸光值0.149的2.74倍；給藥濃度5 μmol/L細(xì)胞增殖居中，到第3天時(shí)細(xì)胞吸光值為0.589，是第一天吸光值0.149的3.95倍。細(xì)胞遷移及浸潤能力利用加martrigel和不加martrigel的transwell小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果如圖1B和1C所示：未給藥組細(xì)胞遷移和浸潤能力高于給藥組細(xì)胞，說明NTSR1特異性拮抗劑SR48692抑制了膽管細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移及浸潤。見圖1。

圖1 NTSR1抑制劑對(duì)膽管癌細(xì)胞系細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

2.2NTSR1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建立:將培養(yǎng)的RBE、HUCCT1、HCCC 9810、 CCLP-1四株膽管癌細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，用WESTERN BLOT的方法檢測(cè)RBE、HUCCT1、HCCC 9810、 CCLP-1四株膽管癌細(xì)胞中的NTSR1，結(jié)果如圖2A所示：HUCCT1細(xì)胞表達(dá)量較高，選取該細(xì)胞進(jìn)行改造。通過慢病毒轉(zhuǎn)染HUCCT1細(xì)胞，構(gòu)建過表達(dá)NTSR1的細(xì)胞株HUCCT1-NTSR1和敲減NTSR1的細(xì)胞株HUCCT1-siNTSR1，用WESTERN BLOT的方法檢測(cè)改造后細(xì)胞NTSR1的表達(dá)差異。結(jié)果如下圖2B所示，NTSR1在敲減后細(xì)胞株HUCCT1-siNTSR1，過表達(dá)細(xì)胞株HUCCT1-NTSR1與正常的HUCCT1表達(dá)差異明顯，細(xì)胞株構(gòu)建成功。

2.3改造后細(xì)胞株增殖遷移浸潤檢測(cè):對(duì)改造成功的細(xì)胞HUCCT1-NTSR1，HUCCT1-siNTSR1進(jìn)行增殖遷移和浸潤的檢測(cè)。結(jié)果如圖3。MTS檢測(cè)改造前后細(xì)胞增殖能力的改變，如圖3A:過表達(dá)細(xì)胞株HUCCT1-NTSR1增殖最快，在第3天時(shí)細(xì)胞吸光值為1.123，是第1天吸光值0.151的7.44倍，敲減的HUCCT1-siNTSR1細(xì)胞增殖最慢，到第3天時(shí)細(xì)胞吸光值為0.523，是第一天吸光值0.146的3.58倍；正常的HUCCT1細(xì)胞增殖居中，到第3天時(shí)細(xì)胞吸光值為0.818，是第一

圖2A：不同細(xì)胞NTSR1表達(dá)量檢測(cè);圖2B：改造前后HUCCT1細(xì)胞株NTSR1檢測(cè)圖2 不同膽管細(xì)胞癌細(xì)胞及改建后HUCCT1細(xì)胞株NTSR1表達(dá)檢測(cè)

天吸光值0.147的5.56倍。細(xì)胞遷移及浸潤能力利用加martrigel和不加martrigel的transwell小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3B和圖3C所示：敲減組細(xì)胞遷移和浸潤能力低于正常細(xì)胞，過表達(dá)細(xì)胞組遷移和浸潤能力高于正常細(xì)胞，說明NTSR1表達(dá)量差異影響了膽管細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移及浸潤，表達(dá)越高，遷移浸潤能力越強(qiáng)，反之則越弱。體內(nèi)成瘤試驗(yàn)結(jié)果顯示：HUCCT1-NTSR1細(xì)胞皮下接種的10只裸鼠在第3周時(shí)有9只成瘤，HUCCT1-siNTSR1細(xì)胞接種的10只裸鼠中在第5周有4只成瘤，其他6只未能成瘤。HUCCT1細(xì)胞接種的10只裸鼠在第4周有7只成瘤，另有一只在第5周成瘤，另外2只未能成瘤。結(jié)果顯示HUCCT1-NTSR1細(xì)胞成瘤最快，成瘤數(shù)量最多。

圖3A：MTS檢測(cè)改造后膽管癌細(xì)胞增殖率;圖3B：使用transwell進(jìn)行遷移測(cè)定;圖3C：使用涂有Matrigel的Boyden室進(jìn)行浸潤測(cè)定圖3 改造后膽管癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖遷移浸潤能力檢測(cè)

2.4改造后細(xì)胞株增殖遷移浸潤檢測(cè):用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)膽管細(xì)胞癌細(xì)胞HUCCT1以及敲減NTSR1的細(xì)胞株HUCCT1-siNTSR1中MAPK通路三個(gè)關(guān)鍵活性分子ERK1/2、P38MAPK、JNK及顯著差異表達(dá)基因PKC的蛋白磷酸化水平變化，結(jié)果如圖4A所示，敲減 NTSR1后ERK1/2磷酸化水平明顯下降，預(yù)示NTSR1可能與MAPK通路的ERK1/2磷酸化水平相關(guān)。

進(jìn)一步試驗(yàn)在過表達(dá)NTSR1的膽管細(xì)胞癌細(xì)胞細(xì)胞系中應(yīng)用P38MAPK特異性抑制SB203580、ERK1/2特異性抑制劑U0126和JNK特異性抑制劑SP600125處理細(xì)胞，檢測(cè)在抑制劑作用下細(xì)胞增殖，侵襲以及凋亡的變化。結(jié)果如圖4B、圖4C、圖4D所示：加入P38MAPK特異性抑制SB203580和JNK特異性抑制劑SP600125通道抑制劑，增殖，侵襲和凋亡的變化差異不顯著。而加入ERK1/2特異性抑制劑U0126，細(xì)胞增殖能力和侵襲顯著下降，凋亡比例上升。證實(shí)NTS/NTSR1軸與MAPK信號(hào)通路ERK1/2有關(guān)。

圖4A：敲減NTSR1前后ERK1/2、P38MAPK、JNK及PKC磷酸化水平檢測(cè);圖4B： 加入抑制劑后細(xì)胞增殖能力檢測(cè);圖4C：加入抑制劑后細(xì)胞侵襲能力檢測(cè);圖4D：加入抑制劑后細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖4 NTS/NTSR1軸作用與MAPK通路的ERK1/2相關(guān)

3 討論

膽管癌(CCA)是一種罕見的腺癌，起源于膽管上皮細(xì)胞，位于肝內(nèi)外膽管的任何部位，不包括壺腹和膽囊。它是世界范圍內(nèi)最致命的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤之一，也是最常見的膽道惡性腫瘤[10-11]。CCA患者的轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)率很高，因此CCA患者的預(yù)后仍然很差[12]。在之前的研究中首次闡明神經(jīng)降壓素NTS過度表達(dá)與CCA患者預(yù)后不良密切相關(guān)的研究，提示NTS可能是CCA患者預(yù)后良好的生物標(biāo)志物[13]。NTS的各項(xiàng)生理功能主要通過與其結(jié)合的神經(jīng)降壓素受體(neurotensin receptors，NTSRs)介導(dǎo)，目前已知的受體有3種，分別是NTSR1，NTSR2和NTSR3。其中NTSR1和NTSR2為NTS特異性受體，都屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族(G-protein-coupled receptors，GPCRs)成員，且都具有7次跨膜區(qū)，但NTS與NTSR1高度親和，而與NTSR2親和力較低。

本文旨在研究NTSR1在膽管癌細(xì)胞的增殖，遷移，浸潤中的作用，探明NTS/NTSR1在膽管癌的增殖轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制。通過研究發(fā)現(xiàn)NTSR的特異性抑制劑SR48692能有效的抑制膽管癌細(xì)胞HUCCT1的增殖，遷移和浸潤。改造HUCCT1細(xì)胞NTSR1的表達(dá)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)敲減NTSR1的細(xì)胞HUCCT1-siNTSR1的增殖，遷移，浸潤能力遠(yuǎn)低于過表達(dá)的細(xì)胞株HUCCT1-NTSR1，未改造的細(xì)胞HUCCT1的增殖，遷移和浸潤能力居于二者之間。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HUCCT1-NTSR1成瘤率最高，HUCCT1居中，HUCCT1-siNTSR1成瘤率最低。研究結(jié)果顯示，NTSR1特異性拮抗劑SR48692對(duì)人膽管細(xì)胞癌細(xì)胞增殖侵襲均有抑制作用,NTSR1在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)差異影響膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)改造后膽管細(xì)胞癌細(xì)胞HUCCT1中MAPK通路三個(gè)關(guān)鍵活性分子ERK1/2、P38MAPK、JNK及顯著差異表達(dá)基因PKC的蛋白磷酸化水平變化，結(jié)果顯示敲減NTSR1后ERK1/2磷酸化水平明顯下降，預(yù)示NTSR1可能與MAPK通路的ERK1/2磷酸化水平相關(guān)。進(jìn)一步應(yīng)用P38MAPK特異性抑制SB203580、ERK1/2特異性抑制劑U0126和JNK特異性抑制劑SP600125處理細(xì)胞，驗(yàn)證結(jié)果顯示P38MAPK特異性抑制SB203580和JNK特異性抑制劑SP600125對(duì)細(xì)胞增殖，遷移和凋亡影響不顯著，而ERK1/2特異性抑制劑U0126對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡影響顯著，證明NTS/NTSR1軸與MAPK信號(hào)通路ERK1/2有關(guān)。