湛江地區(qū)凡納濱對(duì)蝦肝腸胞蟲檢出實(shí)例分析

謝艷輝，李家僑，斯?jié)啥鳎嵤嬉谓馂常瑥埬?/p>

（湛江海關(guān)技術(shù)中心，廣東 湛江 524000）

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei, EHP）屬于微孢子蟲科，腸胞蟲屬，最早在泰國生長緩慢的斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）中發(fā)現(xiàn)[1]，2009 年首次被分離和命名[2]。與之前所報(bào)道的感染對(duì)蝦的微孢子蟲不同，EHP 只侵染對(duì)蝦肝胰腺組織，可感染斑節(jié)對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）等養(yǎng)殖蝦類。自2009 年被分離與命名后，EHP 成為近年來影響全球?qū)ξr養(yǎng)殖生產(chǎn)較嚴(yán)重的疾病之一，亞洲的EHP 在凡納濱對(duì)蝦中已達(dá)到流行病學(xué)程度[3]，我國也有很多報(bào)道。2015 年，江蘇地區(qū)在全年較少發(fā)生白斑綜合征的情況下，由于EHP 導(dǎo)致一半的養(yǎng)殖戶虧損，EHP 已成為影響我國沿海地區(qū)凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大障礙[4]。2016—2017 年我國粵西地區(qū)[5]、遼寧[6]及浙江舟山[7]的凡納濱對(duì)蝦中 EHP 均有較高的檢出率。劉珍等[8]利用熒光PCR 方法對(duì)采自山東、江蘇和海南的凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行EHP 檢測(cè)，結(jié)果表明當(dāng)對(duì)蝦肝胰腺中EHP 的SSU rDNA 相對(duì)拷貝數(shù)在103copies/（ng HpDNA）數(shù)量級(jí)或EHP 載量指數(shù)在3 以上時(shí)與體長呈負(fù)相關(guān)。以上報(bào)道均表明該病致死率不高，但會(huì)導(dǎo)致對(duì)蝦生長緩慢。

目前對(duì)EHP 的檢測(cè)技術(shù)包括普通PCR 方法[9-10]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法[11]及熒光PCR 方法等[8]。Thitamadee 等[3]通過不同方法比較認(rèn)為，巢式PCR 是最優(yōu)的檢測(cè)EHP 的方法。由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等單位編寫的《2019 我國水生動(dòng)物重要疫病狀況分析》提到，EHP 在養(yǎng)殖蝦較密集的湛江地區(qū)檢出率較高，但目前對(duì)于EHP 的發(fā)生與環(huán)境因子的關(guān)系研究較少，為了解EHP 與養(yǎng)殖環(huán)境的關(guān)系，2020 年4 月，采集了不同養(yǎng)殖場(chǎng)的凡納濱對(duì)蝦樣品，采用巢式PCR 方法檢測(cè)EHP，同時(shí)收集不同的養(yǎng)殖環(huán)境數(shù)據(jù)，對(duì)EHP 與環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行分析。此次檢測(cè)為我國對(duì)蝦EHP 的流行病學(xué)分析提供了重要資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)池塘 為了解不同養(yǎng)殖模式下EHP 與環(huán)境因子的關(guān)系，選取湛江地區(qū)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖基地兩口高位池（標(biāo)記為G1、G2）和兩口低位池（D1、D2）為試驗(yàn)池塘。所有的池塘均無混養(yǎng)，放苗前期均有培藻，養(yǎng)殖過程中均需每天換水約5 cm 深。池塘規(guī)格及蝦苗放養(yǎng)情況見表1。

表1 試驗(yàn)池塘基本情況

1.1.2 儀器及試劑 儀器：HI9828 多參數(shù)防水型水質(zhì)測(cè)定儀，PCR 擴(kuò)增儀（美國ABI 公司），凝膠成像儀（德國Biometra 公司），高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf centrifuge 5417R），電泳儀（DYY-8C，北京市六一儀器廠）。

試劑：10×PCR buffer（Mg2+ Plus），TaqDNA 聚合酶，dNTP、DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000，瓊脂糖，均為大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集及各環(huán)境指標(biāo)的分析測(cè)定 連續(xù)一周采集不同蝦池的養(yǎng)殖水樣，現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量水溫、鹽度、pH 值和溶解氧（DO），并于第 7 d 采集蝦樣,分別密封后冷凍保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析，蝦樣分別標(biāo)記為G1X、G2X、D1X 和D2X。取蝦樣的肝胰腺組織約100 mg 放入離心管中，加入1 mL 的PBS溶液（濃度0.1 mol/L）研磨破碎后離心，取上清液備用。

1.2.2 核酸提取 采用ABI 公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒（MagMAXTM-96 DNA Multi-Sample Kit）進(jìn)行抽提，樣品為50 μL 離心后的上清液。

1.2.3 nested-PCR 所用引物參考文獻(xiàn)[10]，引物序列、擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序如下。

（1）套式PCR 第一步。在PCR 反應(yīng)管中，依次加入試劑：10×PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，引物ENF779 和 ENR779 各 0.5 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA 聚合酶 0.5 μL，模板 5 μL，然后加水至 25 μL，混勻后低速離心，使液體集中在底部。按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，68 ℃45 s，30 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸 5 min。（2）套式 PCR第二步。在PCR 反應(yīng)管中，依次加入以下試劑：10×PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，引物 ENF176 和ENR176各0.5 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA 聚合酶 0.5 μL，第一步 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物 1 μL，然后加水至25 μL，混勻后低速離心，使液體集中在底部。按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃30 s，68 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸 5 min。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 本試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及作圖主要采用Excel 軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 養(yǎng)殖水理化指標(biāo)

2.1.1 各養(yǎng)殖場(chǎng)理化因子變化情況 各養(yǎng)殖場(chǎng)溫度、鹽度、pH 值和 DO 變化見圖 1（a）（b）（c）（d）。

由圖1（a）可見，總體上高位池溫度比低位池高，高位池溫度為 24.12～27.08 ℃，第 3 d 采樣期間下雨，溫度稍有下降，隨后基本穩(wěn)步上升，低位池溫度為24.02～25.57 ℃，隨著采樣時(shí)間變化基本上為上升狀態(tài)。由圖1（b）可見，高位池鹽度顯著高于低位池，高位池鹽度為28.32～30.32，低位池鹽度為5.46～6.69，各池塘內(nèi)鹽度基本上穩(wěn)定，變化不大。由圖1（c）可見，隨著養(yǎng)殖時(shí)間增加，總體看來，低位池 pH 值比高位池低，高位池 pH 值為 5.43～7.25，第4 d 稍有上升，隨后下降，低位池pH 值為3.64～7.70，隨時(shí)間變化基本呈下降趨勢(shì)。由圖1（d）可見，總體看來，高位池DO 濃度比低位池高，高位池ρ（DO）為 24.12～27.08 mg/L，第 3 d 由于下雨，導(dǎo)致水體中光合作用降低，ρ（DO）下降，隨后逐步上升；低位池 ρ（DO）為 24.02～25.57 mg/L，隨時(shí)間變化呈上升趨勢(shì)，但總體較為平穩(wěn)。

圖1 各養(yǎng)殖場(chǎng)溫度、鹽度、pH 值和DO 變化情況

2.1.2 各因子差異分析 采用單因素方差分析的方法分別對(duì)相同養(yǎng)殖方式的池塘及不同養(yǎng)殖方式的池塘的溫度、鹽度、pH 值和ρ（DO）進(jìn)行差異分析，結(jié)果見表2 和表3。由表2 和表3 可見，相同養(yǎng)殖方式的池塘各因子均沒有顯著差異（P＞0.05），而不同養(yǎng)殖方式的池塘溫度、鹽度和ρ（DO）差異極顯著（P＜0.05），pH 值沒有顯著差異。

表2 各池塘間理化因子差異分析

表3 高、低位池理化因子差異分析①

2.2 病原檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 肝腸胞蟲套式PCR 試驗(yàn)結(jié)果 取7 μL 反應(yīng)產(chǎn)物加入1%瓊脂糖凝膠內(nèi)進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖2所示。4 個(gè)樣品在PCR 第一步?jīng)]有出現(xiàn)條帶，PCR第二步反應(yīng)出現(xiàn)了176 bp 的條帶，同陽性對(duì)照條帶一致。

圖2 巢式PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序與序列同源性比對(duì) PCR 擴(kuò)增條帶經(jīng)上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，結(jié)果同GenBank 中參考序列進(jìn)行比對(duì)，與EHP 同源性為100%，可確認(rèn)4 個(gè)樣品結(jié)果均為EHP 感染。

2.3 討論

研究所選取的4 口池塘內(nèi)對(duì)蝦均表現(xiàn)出一定的生長緩慢特性，結(jié)合病原檢測(cè)可以確定為EHP感染，不同養(yǎng)殖方式的理化因子差異顯著，鹽度、pH 值范圍跨度較大，但是均檢測(cè)出EHP，說明EHP對(duì)于外部環(huán)境可能具有較高的適應(yīng)性，水質(zhì)變化不影響其生長傳播。目前對(duì)于水質(zhì)與EHP 相關(guān)性的研究較少，陳曉玲等[12]對(duì)日照地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦流行EHP 病情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)EHP 的爆發(fā)與養(yǎng)殖池中水質(zhì)變化無直接關(guān)系，與本研究結(jié)果一致。本研究只選取了4 口池塘進(jìn)行了短期的跟蹤研究，不具有代表性。后續(xù)若需進(jìn)一步了解EHP 與養(yǎng)殖環(huán)境的關(guān)聯(lián)性以及EHP 的流行病學(xué)特征，還要進(jìn)行大量、長期的試驗(yàn)調(diào)查工作，結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。

EHP 體長以μm 計(jì)，主要寄生于對(duì)蝦肝胰腺小管上皮細(xì)胞中，EHP 導(dǎo)致受感染的對(duì)蝦生長停滯，個(gè)體大小差異明顯，且會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的繼發(fā)感染。在泰國養(yǎng)殖的感染白便綜合征的凡納濱對(duì)蝦中，EHP 檢出率較高。但人工感染實(shí)驗(yàn)證明，EHP并不會(huì)導(dǎo)致白便綜合征[10]。陳祿芝等[5]、王雅博等[6]和劉寶彬等[13]均發(fā)現(xiàn)EHP 與傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）混合感染比例較高，可能是由于兩種病原均感染的是對(duì)蝦的組織器官，其中一種感染造成器官的病變后，另一種病原更易入侵。凡納濱對(duì)蝦感染以上兩種病原后均未死亡，表現(xiàn)的癥狀均為發(fā)育遲緩，因此極易將EHP當(dāng)成IHHNV。另有研究表明，EHP 的感染主要發(fā)生在幾種病毒或是淋巴器官及造血組織的病原體感染中，健康的小蝦被感染的相對(duì)較少[2]。結(jié)合之前研究結(jié)果，EHP 主要導(dǎo)致對(duì)蝦生長緩慢。據(jù)調(diào)查得知，本研究中的蝦苗還出現(xiàn)了一定數(shù)量的死亡現(xiàn)象，根據(jù)EHP 和IHHNV容易造成對(duì)蝦混合感染的事實(shí)可推斷，蝦苗的死亡可能是多種病原并發(fā)感染導(dǎo)致。目前以上幾種病原的檢測(cè)技術(shù)都已經(jīng)很成熟，在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)癥狀應(yīng)當(dāng)及時(shí)進(jìn)行病原檢測(cè)，好對(duì)癥下藥，及時(shí)止損。

EHP 可進(jìn)行垂直和水平傳播。水平傳播指通過攜帶EHP 的水體和取食病蝦殘?bào)w使健康蝦感染[10]，或通過攝食攜帶EHP 的鮮活餌料使孢子體在對(duì)蝦中傳播[14-16]；垂直傳播指感染了EHP 的親本蝦將EHP 傳染給子代[17]。有研究表明，該病主要來源于活餌料（如多毛類）的應(yīng)用，因?yàn)樵趤喼薇镜鼗蜻M(jìn)口的活餌料中均檢出了EHP 陽性，主要是因?yàn)轲B(yǎng)殖場(chǎng)在標(biāo)粗過程中將蝦苗在不同的養(yǎng)殖池內(nèi)轉(zhuǎn)移，處理不當(dāng)?shù)酿B(yǎng)殖池中可能存在EHP[3]，EHP 感染對(duì)蝦后，在肝胰腺細(xì)胞內(nèi)形成胞原質(zhì)，成熟后可通過消化道排出體外，散于水體并附著于藻類等表面，威脅健康對(duì)蝦。Salachan 等[16]將感染了EHP 的對(duì)蝦與健康對(duì)蝦放入一個(gè)共生系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)EHP 對(duì)健康對(duì)蝦有100%感染率。由表1可知，目前不同養(yǎng)殖模式下的養(yǎng)殖密度均較高，尤其是高位池。目前我國凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖量很大，一旦有蝦感染了EHP，在如此高密度養(yǎng)殖池中，EHP 的傳播將很難得到控制，因此從源頭控制十分必要。

3 結(jié)語

通過對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體理化因子的連續(xù)監(jiān)測(cè)，以及對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦的病原檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)EHP的傳播、發(fā)生與養(yǎng)殖池中水質(zhì)變化無直接關(guān)系。EHP 感染雖未導(dǎo)致對(duì)蝦死亡而僅是影響其生長，但該病多與其他疫病并發(fā)感染，從癥狀上很難判斷是否感染EHP，且造成的損失十分巨大，因此早進(jìn)行病原檢測(cè)有助于早發(fā)現(xiàn)早治療。目前EHP 不在世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）疫病名單上，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也未將其列入《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》，究其來源，進(jìn)口的無特定病原體（SPF）種蝦及餌料也可能攜帶EHP，供應(yīng)商或檢疫機(jī)構(gòu)應(yīng)將該病放入SPF 檢疫名單[3]。就目前該病在我國流行情況看來，建議及早制定相應(yīng)的檢疫措施和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，并將該病列入我國檢疫性水生動(dòng)物疫病名單。