復方中藥發酵飼料對母豬繁殖性能、血清生化指標和腸道菌群的影響

沈學懷，張丹俊，趙瑞宏，潘孝成，尹 磊，戴 銀，胡曉苗，周學利，侯宏艷

（安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，安徽省畜禽疫病研究中心，畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室，安徽合肥 230031）

多年來，抗生素作為促生長類飼料添加劑在保證畜禽健康和提高畜禽生產性能方面起到很大的作用，但大量抗生素的使用帶來了畜禽產品抗生素超標、致病細菌耐藥性增強等問題[1-3]。隨著近年來獸用抗生素使用的嚴格監管，我國已經在2020 年7 月1 日規定禁止使用抗生素藥物作為畜禽飼料添加劑[4]。中藥作為綠色無公害的飼料添加劑逐漸受到重視，其具有毒副作用小、不易產生耐藥性、作用效果持久、無殘留污染等特點，其在提高畜禽生產性能、調節畜禽免疫力、降低料肉比等方面已得到很多的研究和實踐證實[5-8]。

隨著中藥加工技術的發展，以傳統中藥為基礎的現代中藥發酵技術迅速成為研究熱點。單方或復方中藥通過益生菌發酵可以代謝產生各種功效的酶，可能會將中藥的某些成分分解轉化成新的有效成分，并能將某些中藥的毒性成分分解，以降低使用中藥的毒副作用，從而提高療效、改變藥物性能和擴大藥物適應癥[9]。因此，發酵中藥作為飼料添加劑在未來養殖畜牧等行業具有廣闊的應用前景。本研究采用商品名為“茶酵肽”的復方中藥發酵飼料飼喂母豬，對母豬的繁殖性能、血液生化指標和腸道微生物進行分析和測定，探討復方中藥發酵飼料對母豬生產性能的影響及其作用機制，以期為復方中藥發酵飼料在母豬生產上的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 復方中藥發酵飼料（茶酵肽）的主要中藥成分包括黃芪、黃芩、金銀花、連翹、桔梗、紫花地、板藍根、魚腥草、甘草、陳皮、女貞子。將中藥粉碎后加入豆粕、葡萄糖、茶粉、蛋白粉，經乳酸菌發酵而成。復方中藥發酵飼料的主要成分如表1 所示。

1.2 試驗設計 試驗選取20 頭2 胎齡經產母豬（安徽祥泰農業開發有限公司），隨機分為試驗組和對照組，每組10 頭。對照組母豬飼喂基礎飼料，試驗組母豬飼喂含20% 復方中藥發酵飼料的混合飼料。復方中藥發酵飼料在使用時是將常規基礎飼料和復方中藥發酵飼料按比例充分混合后使用，復方中藥發酵飼料的添加比例為混合飼料總量的20%。2 組母豬的飼養管理條件一致。基礎飼料的營養成分如表2 所示。

表2 基礎飼料主要營養成分 %

1.3 母豬繁殖性能分析 試驗期從母豬妊娠第30 天開始至分娩后第30 天結束，統計試驗組和對照組母豬的平均產活仔數、平均弱仔率和仔豬腹瀉率。平均活仔數=總活仔數/窩數；平均弱仔率=總弱仔數/總活仔數；仔豬腹瀉率=腹瀉仔豬數/總活仔數。

1.4 血清生化指標測定 試驗期30 d，分別在試驗的第0、15、30 天通過前腔靜脈采集兩組母豬血液。血液經2 000 r/min 離心5 min，分離出血清、保存。所有血清樣品中的總超氧化物歧化酶（T-SOD）、還原型谷胱甘肽氧化酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、丙二醛（MDA）含量測定和結果計算均參考各自檢測試劑盒（南京建成生物工程研究院）的說明書執行。

1.5 腸道微生物菌群測定 在試驗第15 天，收集2 組母豬新鮮糞便樣品，每組8 份，共計16 份，每份樣品約150 mg，放入無菌EP 管中，密封，立即投入干冰中保存、運輸，后置于-80℃冰箱進行保存。采用 DNA抽提試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）對樣本的基因組 DNA 進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000 檢測 DNA 的完整性和濃度[10]。在Illumina MiSeq 平臺上，以基因組 DNA 為模板，針對區域16S V3-V4 區（引物 343F 和 798R）進行擴增，使用帶 barcode 的特異引物，TaKaRa 公司的 Tks Gflex DNA Polymerase 進行PCR，確保擴增效率和準確性。PCR 產物使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后作為二輪 PCR 模板，并進行二輪 PCR 擴增，并再次使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后對 PCR產物進行 Qubit 定量。根據 PCR 產物濃度進行等量混樣后上機進行Illumina 高通量測序。通過barcode 分揀數據并且將PE reads 拼接成Tag[11]。測序工作在上海歐易生物醫學科技有限公司進行。原始數據為 FASTQ 格式。使用 Trimmomatic 軟件對原始雙端序列進行去雜。去雜后的雙端序列利用 FLASH 軟件進行拼接并去除上、下游引物。同時，利用 UCHIME 檢測并去除序列中的嵌合體序列。測序數據進行預處理生成優質序列之后，采用 Vsearch 軟件，根據序列的相似性，對所有樣品的Effective tags 進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units）。基于上述3 個軟件計算樣品的α多樣性及稀釋曲線，涉及到的指數有Shannon、Chao、Simpson、PD whole tree等。通過Unifrac 距離矩陣進行β多樣性分析，并分別繪制加權與非加權的主坐標分析圖（PCoA）。物種比對注釋使用 Blast[12]軟件，在分類學各水平上（門、綱、目、科、屬）進行物種注釋，并繪制相應的柱狀圖。在Qiime 中利用對各組的核心菌群進行篩選，并繪制相應的柱狀圖。

1.6 統計分析 試驗數據用Excel 2007 進行初步整理，利用 SPSS 16.0 軟件進行以上統計學分析，不同組之間的顯著性差異通過進行 One-Way ANOVA 進行判斷（t檢驗），試驗結果均用平均值± 標準差表示。P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。各指標間的相關性采用SPSS 16.0 軟件中的相關系數矩陣Pearson 方法進行分析。

2 結果

2.1 復方中藥發酵飼料對母豬繁殖性能的影響 如表3所示，使用復方中藥發酵飼料母豬的平均窩產活仔數由原來的9.90 頭升高到10.50 頭，試驗組平均窩產弱仔率較對照組降低2.74%；與對照組相比，試驗組仔豬平均腹瀉率降低（P＜0.05）。結果表明，飼喂復方中藥發酵飼料可提高母豬的均窩產活仔數，降低平均窩產弱仔率和仔豬腹瀉率。

表3 母豬飼喂復方中藥發酵飼料對母豬生產性能的影響（n=10）

2.2 復方中藥發酵飼料對母豬血液生化指標的影響 如表4 和表5 所示，試驗組血清T-SOD 水平在使用復方中藥發酵飼料后逐漸升高（P＜0.05）；試驗組血清T-SOD水平在第15 天和30 天極顯著高于對照組。試驗組血清GSH-Px 水平與T-SOD 變化一致，并且試驗組血清GSH-Px 水平在第15 天和30 天極顯著高于對照組。試驗組CAT 水平在第15 天和30 天呈逐漸升高的趨勢（P＜0.05）；在第15 天和30 天試驗組血清CAT 水平極顯著高于對照組。在試驗第15 天和30 天，試驗組血清MDA、ALT/GPT 和AST/GOT 水平均顯著或極顯著低于對照組。生化指標檢測結果表明，飼喂復方中藥發酵飼料可顯著升高母豬的血清抗氧化水平，降低機體應激損傷。

表4 復方中藥發酵飼料對母豬血清抗氧化指標的影響（n=10）

表5 復方中藥發酵飼料對母豬血清應激損傷指標的影響（n=10）

2.3 復方中藥發酵飼料對母豬腸道微生物多樣性的影響對試驗組和對照組16 頭母豬的糞便微生物所提取的總DNA 進行16 S rDNA 的V3～V4 區進行擴增和測序，結果16 個樣品獲得clean tags 數量在89 960～93 642，平均長度為410.37～414.42，樣品OUT 數量為2 972～3 686（圖1）。所有樣品中微生物包括24 個門、45 個綱、111 個目、179 個科和391 個屬。糞便樣品微生物Alpha 多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析，包括Chao指數、PD whole tree指數，Shannon 指數 和Simpson 指數等，結果如表6 所示，與對照組相比，復方中藥發酵飼料對母豬糞便微生物的 OUT 數、chao指數、PD whole tree 指數和Shannon 指數均有升高，Simpson 指數略有降低（P＞0.05）。糞便樣品Beta 多樣性分析結果表明，對照組和試驗組表現出了較明顯的組內聚集，樣品根據所處組別相互聚集到一起，說明飼喂復方中藥發酵飼料對母豬腸道微生物菌群有明顯影響。PCoA 聚類分析顯示，與對照組相比，試驗組樣品聚集的范圍更小，說明試驗組的組內微生物結構與組成的相似性更高，結果提示，喂復方中藥發酵飼料可以在一定程度上增加母豬腸道微生物的穩定性。以上結果表明，喂復方中藥發酵飼料可以提高母豬腸道微生物菌群的多樣性和穩定性。

表6 Alpha 多樣性指數比較統計結果（n=8）

圖1 母豬糞便樣品微生物菌群OUT 數量統計結果

2.4 復方中藥發酵飼料對母豬腸道微生物菌群組成和結構的影響 圖2 結果顯示，在門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度較高，其次是螺旋菌門（Spirochaetes）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）和變形桿菌門（Proteobacteria），其中厚壁菌門母豬的糞便樣品微生物菌群中占比最高，其和擬桿菌門的占比超過80%，為母豬的糞便樣品的優勢菌群門類。

圖2 母豬糞便樣品微生物門水平的相對豐度

母豬糞樣品屬水平微生物菌群組成如圖3 所示，屬水平微生物相對豐度超過1% 的共有17 個菌屬，其中1 個屬于螺旋體菌門、9 個屬于厚壁菌門、7 個屬于擬桿菌門；其中相對豐度最高的是瘤胃菌科屬（Ruminococcaceae）菌群。復方中藥發酵飼料對母豬腸道微生物菌群相對豐度的影響如表7 所示，與對照組相比，試驗組的厚壁菌門和纖維桿菌門的相對豐度升高，擬桿菌門、螺旋體菌門、變形桿菌門和脫鐵菌門的豐度降低，其中厚壁菌門顯著高于對照組，螺旋體菌門、變形桿菌門和脫鐵菌門顯著低于對照組。

圖3 母豬糞便樣品微生物屬水平的相對豐度

母豬糞便樣品主要差異菌群屬水平相對豐度比較結果如圖4 所示，與對照組相比，飼喂復方中藥發酵飼料可顯著提高糞便樣品中克里斯滕森氏菌屬R-7 群（Christensenellaceae R-7 group）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、瘤胃菌科UCG-002（Ruminococcaceae_UCG-002）、擬桿菌屬（Bacteroides）、毛螺菌科NK4A136 群（Lachnos piraceae NK4A136 group）和Candidatus Soleaferre 的相對豐度，顯著降低密螺旋體屬2（Treponema 2）、鏈球菌屬（Streptococcus）、副擬桿菌屬（Parabacteroide）和大腸桿菌-志賀氏菌屬（Escherichia -Shigella）的豐度。結果表明，復方中藥發酵飼料對母豬腸道微生物菌群組成和結構具有顯著影響。

圖4 母豬糞便樣品主要差異菌群屬水平相對豐度比較

2.5 母豬繁殖性能、血清生化指標和糞便微生物菌群豐度之間的相關性分析 采用相關系數矩陣Pearson 方法評價飼喂發酵中藥飼料對母豬繁殖性能、血清生化指標（第15 天）和糞便微生物菌群門水平豐度的影響及其指標之間變化的相關性，結果如表8 所示，平均窩產活仔數與血清抗氧化指標（T-SOD、GSH-Px 和CAT）存在一定水平的正相關，但均未達到顯著性水平，而與應激損傷指標（ALT、AST 和MDA）之間存在不同程度的負相關，其中與ALT 之間為顯著負相關，平均窩產活仔數與糞便微生物菌群門水平豐度之間沒有顯著的相關；窩產弱仔率與應激損傷指標之間存在不同程度正相關，其中與ALT 之間為顯著正相關；仔豬腹瀉率與GSH-Px 和CAT存在顯著負相關，與MDA 和AST 之間存在顯著正相關，仔豬腹瀉率與螺旋菌門和脫鐵桿菌門之間存在顯著正相關；血清抗氧化指標（T-SOD、GSH-Px 和CAT）之間存在顯著正相關，而與MDA 和AST 之間存在顯著負相關，血清抗氧化指標與厚壁菌門的豐度存在顯著正相關，與螺旋菌門、變形桿菌門和脫鐵桿菌門豐度之間存在顯著負相關；血清MDA 和AST 水平與螺旋菌門、變形桿菌門和脫鐵桿菌門豐度之間存在顯著正相關，血清AST水平與厚壁菌門的豐度存在顯著負相關。相關性分析結果表明，飼喂發酵中藥飼料對母豬繁殖性能、血清生化指標和糞便微生物菌群的影響存在廣泛的相關性。

表8 母豬繁殖性能、血清指標和糞便微生物菌群門水平豐度之間的相關性分析（n=8）

3 討 論

益生菌發酵中藥可有效改善傳統中藥炮制加工繁瑣、中藥的利用率低和適口性差等問題[13]。本試驗所用的復方發酵中藥飼料包括十幾種中藥成分，并加入豆粕、葡萄糖、茶粉和蛋白粉通過乳酸菌進行發酵制成。益生菌在生長代謝過程中，可破壞植物的細胞壁，使中藥的有效成分進一步釋放[14]。本研究復方發酵中藥飼料中的粗蛋白質含量較常規飼料更高，中藥植物成分的存在使其粗纖維含量也較高。李瑜[15]研究發現，經酵母菌和乳酸菌共同發酵后的中藥發酵液中多酚、多糖、黃酮和蛋白質含量明顯升高。

近年來，國內一些研究人員也關注到發酵中藥作為添加劑對畜禽生產和健康的影響。方磊涵等[16]研究發現，發酵中藥制劑可改善育肥豬肉品質，增強蛋白質代謝，降低血清總膽固醇含量，提高豬的免疫力。研究發現，發酵中藥復方可顯著提高仔豬的生長性能，降低仔豬腹瀉率，并且其效果優于未發酵中藥復方和抗生素[17]。吳道義等[18]研究結果顯示，益生菌發酵中藥能降低斷奶仔豬的耗料增重比和腹瀉率。王坤麗[19]研究發現使用2 種乳酸菌對清瘟敗毒散提取液進行發酵并飼喂斷奶仔豬可顯著提高日增重，顯著降低耗料增重比，同時降低了斷奶仔豬的腹瀉率。喬宏興等[20]研究顯示，發酵黃芪物可顯著提高斷奶仔豬的平均采食量，降低耗料增重比，對斷奶仔豬有明顯的促生長作用。本研究結果顯示，飼喂復方發酵中藥飼料可使母豬的平均窩產活仔豬數提高0.6 頭，窩產弱仔數降低3.37%，仔豬腹瀉率下降7.39%，但因為試驗動物規模小，平均窩產活仔豬數和窩產弱仔數統計檢驗不顯著，有待于擴大試驗群體再做進一步評價。研究發現，影響母豬繁殖性能的因素包括胎次、地域、品種特性和飼養管理等[21]。本研究中的試驗母豬總體的繁殖性能成績不高，而通過飼喂復方發酵中藥飼料可以有效提高母豬的繁殖性能，說明飼料營養和母豬管理可能是影響該母豬群繁殖性能的主要原因。復方發酵中藥飼料在提高母豬繁殖性能方面具有積極作用。

血清抗氧化和應激損傷指標可以客觀反映機體的健康狀態[22]。飼喂中藥制劑可以影響畜禽血清生化指標。朱買勛等[5]研究表明，飼喂中藥可以顯著升雛雞高血清總蛋白和球蛋白含量，顯著降低AST 含量。在肉雞生產上，發酵中藥可以降低熱應激對肉雞產生的負面影響，提高熱應激肉雞的生長性能、免疫和抗氧化功能[23]；在蛋雞上應用發酵中藥能提高其生產性能及抗氧化水平，并能改善蛋雞腸道結構形態[24]。方磊涵等[17]研究發現，中藥復方發酵劑可使斷奶仔豬血清總抗氧化能力（T-AOC）顯著提高，MDA 含量顯著降低。李琳倩等[25]研究表明，與對照組相比，中草藥添加劑顯著提高了后備母豬血清中葡萄糖、賴氨酸、蛋氨酸和甘氨酸含量。本研究結果顯示，飼喂復方發酵中藥飼料的母豬血清中抗氧化指標T-SOD、GSH-Px 和CAT 含量顯著升高，血清中應激損傷指標ALT、AST、MDA 顯著降低，表明飼喂復方發酵中藥飼料可顯著提高母豬的抗氧化能力，降低應激損傷水平。

腸道微生物菌群從功能上可以分為共生、益生和病原微生物三大類，其中最主要的是細菌，還包括真菌、病毒和噬菌體，它們在腸道中保持著一種動態平衡[26]。腸道微生物發揮多種重要功能，包括物質代謝、生物屏障、免疫調控及宿主防御等[27]。因此，腸道微生物和機體存在著互利共生的關系，對于維持機體健康發揮著重要作用。中藥作為潛在抗生素替代品在調節腸道微生物菌群方面具有顯著作用。邵志勇等[28]研究發現在蛋雞飼料中添加中藥可以顯著提高腸球菌屬、芽孢桿菌屬和梭菌屬的豐度，擬桿菌屬微生物豐度明顯降低。發酵中藥制劑所用的發酵菌種都是益生菌，益生菌在腸道內生長定植可競爭性地排斥致病菌，更有利于平衡胃腸道菌群[9,13]。研究發現，飼喂中藥復方發酵飼料可顯著提高斷奶仔豬腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌數量，降低大腸桿菌數量[17]。本研究結果顯示，飼喂復方中藥發酵飼料可以在一定程度上增加母豬腸道微生物菌群的多樣性和穩定性，并且可顯著提高母豬糞便樣品中厚壁菌門的豐度，降低螺旋體菌門、變形桿菌門和脫鐵菌門的豐度；在屬水平，試驗組母豬糞便樣品中克里斯滕森氏菌屬R-7 群、乳桿菌屬、瘤胃菌科UCG-002 和擬桿菌屬等有益菌群的豐度顯著升高，鏈球菌屬、副擬桿菌屬和大腸桿菌-志賀氏菌屬的豐度顯著降低。

本試驗腸道微生物菌群門水平豐度與母豬繁殖性能和血清生化指標的相關性分析中，腸道菌群中螺旋菌門和脫鐵桿菌門的豐度與仔豬腹瀉率之間存在直接顯著正相關；而微生物菌群門水平豐度的變化與母豬血清生化指標之間存在廣泛相關性，如厚壁菌門與血清抗氧化指標顯著正相關，螺旋菌門、變形桿菌門和脫鐵桿菌門與其存在顯著負相關。Mardinoglu 等[29]研究發現，腸道微生物可以調節宿主機體的谷胱甘肽和氨基酸的代謝，谷胱甘肽在機體免疫、營養物代謝等方面具有重要的調節作用。本研究結果與Mardinoglu 等[29]的研究結果一致，血清GSH-Px 水平與厚壁菌門顯著正相關，而與螺旋菌門、變形桿菌門和脫鐵桿菌門與其存在顯著負相關，說明腸道微生物菌群變化可以顯著影響血清的抗氧化水平。對母豬血清生化指標與母豬繁殖性能之間的相關性分析發現，兩者之間存在較為緊密的相關性，其中ALT與平均窩產活仔數顯著負相關，與平均弱仔率顯著正相關，GSH-Px 和CAT 與仔豬腹瀉率顯著負相關，MDA和AST 則與仔豬腹瀉率顯著正相關。研究發現，妊娠后期和泌乳期的母豬，尤其是初產母豬，代謝非常旺盛，這導致母豬在圍產期可能會產生氧化應激，造成母豬產仔性能下降、泌乳力降低和仔豬成活率下降[30]。母豬血液中MDA、GSH-Px 和T-AOC 變化反映了母豬所處的氧化應激狀態[31]，而微生物源性抗氧化劑[32]和復合有機鐵[33]等外源抗氧化物質可有效提高母豬的機體抗氧化能力和繁殖性能。以上研究均表明，母豬的機體抗氧化水平與母豬的繁殖性能具有顯著相關性。本研究中飼喂的復方中藥發酵飼料具有豐富益生菌、中藥活性成分和高纖維素[34]的特性，其可能通過多種途徑對母豬繁殖性能進行調節，但通過調節腸道微生物菌群和提高機體抗氧化能力可能是其提高母豬繁殖性能的重要途徑式之一。

4 結 論

本試驗結果表明，飼喂復方中藥發酵飼料可顯著提高母豬的繁殖性能，顯著提高母豬機體抗氧化水平，降低機體應激損傷，并可顯著提高母豬腸道有益微生物菌群的豐度。