不同纖維源飼糧對0～4周齡四川白鵝腸道菌群的影響

田 旭，何 航，武秋申，程雅婷，萬 堃，周勤飛，劉安芳，向邦全，章 杰*

（1.西南大學動物科學技術學院，重慶 402460；2.重慶三峽職業學院動物科技學院，重慶 404155；3.重慶市萬州區畜牧技術推廣站，重慶 404000）

動物飼糧中添加適量纖維性物質可促進營養物質的消化吸收來提高生產性能[1-2]，而家禽無纖維素分解酶，只能依靠腸道微生物分泌的酶來消化[3]。飼糧纖維類型可顯著影響動物腸道微生物菌群組成。如Chen 等[4]研究指出，斷奶仔豬飼喂10%麥麩纖維或10%豌豆纖維飼糧可顯著改變腸道菌群結構；Zhao 等[5]研究表明，飼糧中添加 5%麥麩可顯著提高豬糞便中乳酸桿菌與纖維菌數量；Amerah 等[6]研究指出，不同纖維源可影響肉雞腸道微生物菌群特征，從而改變營養物質的消化率。鵝屬草食性家禽，具有耐粗飼的特點，可利用高纖維含量的草和秸稈等，其盲腸十分發達，具有類似瘤胃的發酵功能[7]，在營養消化吸收、黏膜代謝、免疫應答等過程中具有重要作用[8-9]。苜蓿、黑麥草、燕麥草和花生秧具有營養價值高、適口性好、產量高等特點。目前，有關這4 種纖維源在鵝生產應用中的研究報道較少，且已有報道多關注于不同纖維源對鵝生長性能、胴體特征和腸道發育等方面的影響[10-11]，對腸道微生物的報道較少。育雛期0～4 周齡的鵝生長發育迅速，腸道菌群處于定植和構建的關鍵時期[12]。因此，本研究旨在探討苜蓿、黑麥草、燕麥草和花生秧4 種纖維源對0～4 周齡四川白鵝腸道微生物菌群的影響，旨在揭示纖維類型與腸道微生物菌群的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和飼糧 選取120 只體重（86.02±6.35）g、體況相近的1 日齡四川白鵝飼喂于西南大學畜牧實訓基地，隨機分為4 組，分別飼喂含苜蓿、黑麥、燕麥或花生秧飼糧（不同草粉纖維組成見表1），每組3 個重復，每個重復10 只鵝，試驗期共28 d。采用半開放式鵝舍，地面平養，常規免疫，自由采食飲水，每日飼喂4 次（07:30、12:30、17:00、21:00）。試驗期環境溫度為（26.20±2.52）℃，濕度（88.50±4.72）%。試驗飼糧組成及營養成分見表2。

表2 試驗飼糧組成及營養成分（風干基礎）

1.2 盲腸內容物樣品采集 28 日齡時，每個重復隨機選取3 只鵝屠宰，迅速取出盲腸并結扎，經75% 酒精擦拭消毒外表后轉移至無菌超凈臺，將同一重復盲腸樣品剪開后混合均勻，用無菌生理鹽水沖洗腸道內壁，沖洗干凈后，用滅菌手術刀片輕輕刮取腸道黏膜，收集于凍存管中，于-80℃保存備用。

1.3 16S rRNA PCR 擴增 使用QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen，德國）提取微生物總DNA。16S rRNA V3-V4 區擴增引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGC AGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3'），其中引物338F 的5'尾端帶有條碼標記。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸90 s，22 個循環；最后72℃延伸8 min。將PCR 產物用QuantiFluorTM-ST 藍色熒光定量系統進行定量檢測，之后按照每個樣本的測序量要求進行相應比例的混合來構建文庫進行Miseq 測序。

1.4 測序序列處理 測序得到雙端序列數據，根據PE reads 之間的overlap 關系，將成對的reads 拼接（merge）成一條序列，允許的最大錯配比率為0.2，最小overlap長度為10 bp，篩選掉不合格序列。根據序列首尾兩端的barcode 和引物區分有效序列，并調整序列方向，barcode 允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2。同時對reads 的質量和merge 的效果進行質控，過濾reads尾部質量值20 以下的堿基，設置50 bp 的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基；并且過濾質控后50 bp 以下的reads，去除含N 堿基的reads。

1.5 生物信息學分析 在97% 相似度下通過Usearch（version 7.1）軟件將序列進行聚類，得到分類操作單元（OTUs）。通過RDP Classifer 將OTUs 代表序列與數據庫Silva 進行比對，置信度閾值為0.6，進而分析物種多樣性指數及群落結構。同時利用序列數量與其所代表的OTU 數目來構建稀釋曲線，以及利用序列數量在不同測序深度時的微生物多樣性指數來構建Shannonwinner 曲線。根據樣本OTU 數據來估計菌群的α多樣性和β多樣性。α多樣性以物種豐富度指數（Chao 和Ace）和多樣性指數（Shannon 和Simpson）表現。對于β多樣性指標，計算加權和未加權的UniFrac 距離矩陣，并通過主坐標分析（PCoA）進行可視化。使用LEfSe 進行組間豐度差異的可視化，首先采用非參數因子Kruskal -Wallis 秩和檢驗檢測組間豐度差異顯著的物種，之后對這些物種進行成對Wilcoxon 秩和檢驗，最后通過線性判別分析（LDA）對數據進行降維和評估差異顯著的物種。

1.6 統計分析 采用SPSS 22.0 統計軟件的GLM 程序進行方差分析，Duncan's 法進行多重比較，P＜0.05 為差異顯著，并用Met-astats 方法對各處理組間物種差異性進行分析。

2 結果與分析

2.1 測序數據評價 如表3 所示，測序共得到有效序列639 041 條，合計233.84 Mp 堿基，平均序列長度439.01 bp。比對得到564 個OTUs，覆蓋率達99.8%以上。各組之間的豐度（OTU、ACE 和Chao1）和多樣性（Shannon 和Simpson）指數無顯著差異。此外，稀釋曲線及Shannon-winner 曲線隨著測序數據量的增加趨于平坦（圖1），表明測序數據量已覆蓋樣本中的絕大多數物種。

圖1 測序數據質量評估

表3 數據統計及多樣性分析

2.2β多樣性分析 如圖2 所示，加權PcoA 分析顯示處理組明顯聚為兩類（苜蓿組與黑麥組，燕麥組與花生秧組），而非加權PcoA 分析則顯示處理組無明顯聚類。雖然加權和非加權PcoA 分析聚類結果不一致，但前者PC1+PC2=50.28% 大于后者PC1+PC2=36.36%，說明加權PcoA 分析結果較可靠，表明飼糧纖維源對鵝腸道微生物菌群結構有一定影響，并且苜蓿組與黑麥組、燕麥組與花生秧的影響較為接近。

圖2 腸道微生物β 多樣性分析

2.3 菌群結構分析 分類學結果顯示，苜蓿組檢出10門106 屬，黑麥組檢出11 門141 屬，燕麥組檢出9 門99 屬，花生秧組檢出9 門105 屬。門水平上，相對豐度大于1% 的有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria），且4 種菌門豐度在各組的占比均高達97%以上（圖3A）。由表4 可見，苜蓿組厚壁菌門（Firmicutes）高于燕麥組（P＜0.05）；黑麥組放線菌門（Actinobacteria）高于花生秧組（P＜0.05）。

屬水平上，處理組間共有菌屬75 個，特有菌屬20個（苜蓿組：5 個；黑麥組：12 個；燕麥組：2 個；花生秧組：1 個）。擬桿菌屬（Bacteroides）和乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度之和在各組占比最高（苜蓿：43.67%；黑麥組：33.37%；燕麥組：55.48%；花生秧組：52.58%）（圖3B）。由表4 可見，黑麥組Clostridiales_vadinBB60_group_norank和Turicibacter菌屬高于燕麥組和花生秧組（P＜0.05）；苜蓿組Lachnospiraceae菌屬高于黑麥組和花生秧組（P＜0.05）。

表4 腸道微生物菌群豐度差異 %

圖3 菌群組成分析

2.4 共有和特有菌群分析 如圖4A 所示，苜蓿組、黑麥組、燕麥組和花生秧組共享165 個OTU，占總OTU數的63.46%，特有OTU 分別有48、57、32、41 個。根據屬分類水平上的注釋和豐度信息，從共享OTU 中選取豐度前50 的屬進行層級聚類（圖4B），結果顯示燕麥組與花生秧組表達模式相似，與PcoA 分析結果一致。對特有菌群進行LEfSe 分析（圖4C）發現，花生秧組的代表性細菌為紅蝽桿菌科（Coriobacteriaceae）（LDA＞2），燕麥組的代表性細菌為硫桿菌屬（Thiobacillus）和 嗜 氫 菌 屬（Hydrogenophilales）（LDA＞2），苜蓿組的代表性細菌為艾森伯格氏菌（Eisenbergiella）和胃氣單胞菌（Gastranaerophilales）（LDA＞2.5）。

圖4 共有和特有微生物種群組成分析

3 討 論

飼糧纖維是指不能被非反芻動物消化道內源酶降解的多糖和木質素，主要成分為非淀粉多糖（纖維素、半纖維素和寡聚糖等）和木質素，其中非淀粉多糖占90%以上[14]。研究表明非淀粉多糖是日糧纖維的可消化部分，且不同纖維源飼糧非淀粉多糖消化率存在差異[15]。本課題組前期研究發現，不同纖維源飼糧可顯著影響4周齡四川白鵝平均日增重，其中添加苜蓿和黑麥草粉可獲得較好的生長性能[13]，這可能是由于不同纖維的組分差異及在腸道內的發酵程度引起的，揭示了纖維與腸道微生物組成之間存在一定關系。

鵝對纖維的消化主要依賴于腸道微生物代謝所產生的纖維酶，該類似瘤胃的消化方式是鵝消化生理的重要組成部分[7]。腸道微生物的種類、數量及其平衡性與動物健康及消化功能密切相關[16]。本研究中不同纖維源飼糧對4 周齡四川白鵝腸道菌群α多樣性指數無顯著影響，表明纖維類型不會改變腸道微生物組成結構，這與周海柱等[17]報道一致。β多樣性分析則顯示處理組明顯聚為兩類（苜蓿組與黑麥組，燕麥組與花生秧組），這是由于苜蓿草和黑麥草、燕麥草和花生秧所含中性洗滌纖維和半纖維素的量接近，兩者具有相似腸道發酵模式。此外，不同草粉所含纖維素、半纖維素、木質素、β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖的含量、可溶性、木質化程度等不同是導致β多樣性存在差異的重要原因[14,18]。

本試驗中，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形桿菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是四川白鵝腸道微生物的主要菌門，這與Gao 等[19]的報道基本一致。研究表明，厚壁菌門（Firmicutes）含有大量分解纖維的細菌[20]。本研究中，苜蓿組厚壁菌門（Firmicutes）顯著高于燕麥組，可能是前者飼糧酸性洗滌纖維含量高于后者，有利于其定植[21]，表明飼糧中添加苜蓿可有效促進纖維素的分解。此外，黑麥組放線菌門（Actinobacteria）顯著高于花生秧組，可能是前者飼糧高酸性洗滌纖維含量促進了放線菌門（Actinobacteria）的增殖[22]。放線菌門（Actinobacteria）能分泌木質素酶和抗生素，可有效改善宿主的纖維消化力和機體免疫力[23]。因此，飼糧中添加黑麥草不僅可提高飼糧適口性，也可提高鵝消化能力和免疫力。

特有菌群LEfSe 分析表明，花生秧組的代表性細菌為紅蝽桿菌科（Coriobacteriaceae），可能與花生秧組飼糧的中性洗滌纖維含量較高有關，該菌屬于腸桿菌科，嗜中性且耐酸，主要參與膽固醇衍生代謝轉化和植物性雌激素的多酚代謝[24]。燕麥組代表性菌群為嗜氫菌科，包括硫桿菌屬（Thiobacillus）和嗜氫菌屬（Hydrogenophilales），前者可一定程度地分解纖維[25-26]。苜蓿組代表性菌群為艾森伯格氏菌（Eisenbergiella）和胃氣單胞菌（Gastranaerophilales），前者可將阿拉伯木聚糖、纖維二糖、果糖和半乳糖轉化為丁酸，而丁酸主要是結腸細胞的能量來源，達到維持結腸黏膜健康的目的[27]。苜蓿組的可溶性非淀粉多糖含量較高，為艾森伯格氏菌（Eisenbergiella）提供了充足的代謝底物。

4 結 論

不同纖維源飼糧對0～4 周齡四川白鵝腸道菌群結構有一定影響，但主要顯著影響部分菌群相對豐度和特有菌群數量，尤其是添加苜蓿和黑麥草可改善腸道菌群組成和數量。因此，在四川白鵝0～4 周齡的飼養過程中可適當添加苜蓿或黑麥草。