基于Meta 分析解析羊腸道細菌優勢菌群

王 彤，劉 倩，嚴 慧，紀守坤，劉 萱，朱美玉，王亞越，劉月琴，張英杰

（河北農業大學動物科技學院，河北保定 071000）

腸道微生物在刺激新生反芻動物腸道免疫系統建立[1]、參與宿主免疫調節方面發揮重要作用[2]，在動物后腸段營養物質降解利用方面也具有重大意義，羊盲腸微生物發酵產生的揮發性脂肪酸占總產量的12%[3]。細菌作為腸道菌數量最大的一類，其多樣性極高，目前已分離鑒定的細菌包括53 個門、26 024 個種[4]，腸道細菌群落受飼料[5-6]、飼養方式[7]、季節[8]和遺傳[9]等多因素影響，不同研究中所獲得的群落多樣性各異，導致研究者對羊腸道微生物群落結構的認知產生爭議。Smith 等[10]研究發現，優勢物種在維護生物群落穩態方面發揮重要作用，動物胃腸道內的優勢菌往往會決定動物機體的采食[11]和免疫[12]等功能，也更容易在腸道中定植生存。因此，腸道中的優勢菌群可能也在維護腸道微生態平衡中發揮重要作用，對羊腸道優勢菌群進行研究對其腸道微生態調控具有重要意義。

Chang 等[13]研究發現，羊腸道菌以密螺旋體屬（Treponema）為絕對優勢屬，其次有琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）和5-7N15。Zhang 等[14]研究發現，小尾寒羊腸道以擬桿菌屬（Bacteroides）、瘤胃球菌屬（Rumi nococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、梭菌屬（Clostri dium）和黃桿菌屬（Flavonifractor）為主。研究結果的差異可能與動物個體差異及樣本過少等因素有關，羊腸道具有普適參考性的優勢菌類型及其豐度區間仍不明確。

Meta 分析能夠有效綜合同一研究內容的不同獨立研究結果，利用系統定量的統計方法，對已發表文獻中的同類數據進行合并分析，獲得全面性的結論，已形成一套嚴謹的流程，在醫學、生態學等領域廣泛應用。因此，本研究采用網狀文獻檢索和Meta 分析法結合，通過對大量文獻的豐富數據進行統計，得到羊腸道優勢菌群的有效豐度區間，從而達成系統性的評價和描述羊腸道優勢菌群及其豐度區間的目的，為羊腸道常駐優勢菌的研究提供有力的證據和合理的參考。

1 材料與方法

1.1 文獻檢索與篩選標準 研究對象為健康羊的優勢菌群種類和豐度。采用中國期刊全文數據庫（CNKI）和Web of Science 2 個平臺，并通過追查已納入文獻的參考文獻進行檢索。檢索時間區間為建庫到2021 年3 月5 日。在中國知網等中文數據庫中，以主題詞“羊”、“腸道”、“菌群結構”、“菌群”、“微生物”、“消化道”和“腸道細菌”進行檢索。在Web of Science 外文數據庫中，以主題詞“sheep”、“Goat”、“Lamb”、“Bacterial Community”、“Intestinal Tract”、“Intestinal Flora”和“Microbiota”進行檢索。

1.2 文獻納入與排除標準 納入指標：①英文和中文文獻；②結局指標：菌群種類、數量、豐富度與多樣性；③試驗動物為斷奶后的羊。排除標準為：①只能獲取摘要且無法與作者獲得聯系的文獻；②研究對象不符合的特殊樣本（哺乳期羔羊；瘤胃菌群；小腸菌群）；③數據不全的文獻（結果和附表中只有圖或文字表述，未給出門或者屬的具體豐度信息；未給出SD、SE 或SEM值）；④未公開發表，重復報道或信息不完整的文獻；⑤綜述、個案報道或基礎研究等類型的相關文獻。

1.3 資料提取 由研究者進行資料的提取并反復核對，信息提取由研究特征、研究對象的特征和結局指標3 部分組成，包括作者、發表時間、實驗方法、研究對象類別、樣本量、試驗組、對照組、微生物豐度、標準誤等。

1.4 統計分析 采用R-4.0.0 軟件進行方差倒數法Meta分析，合并效應量為微生物豐度，計算合并之后的點估計值及95%的可信區間（CI）。若原始數據只提供中位數、標準差SD 及樣本量N，通過公式計算標準誤SE。利用I2和P 進行綜合判斷是否存在統計學異質性，P＞0.1，I2＜50%，表示存在同質性或異質性很小，采用固定效應模型；P＜0.1，I2＞50%，表示存在較大異質性，采用隨機效應模型。使用R-4.0.0 軟件繪制漏斗圖評價發表偏倚，Thompson 算法計算偏倚顯著性，P＜0.05，不對稱漏斗形表明可能存在發表偏倚；P＞0.05，對稱的漏斗形則表示不存在發表偏倚。

2 結果與分析

2.1 文獻檢索和篩選 本研究經過初步檢索共獲得相關文獻1 413 篇，在簡單閱讀摘要后剔除重復文獻和不符合要求的文獻640 篇，通過閱讀文章內容，排除602 篇（包括文獻綜述43 篇，觀察性實驗108 篇，菌種致病研究234 篇，治療方案201 篇，會議、報紙等16 篇），獲得38 篇文獻，閱讀試驗內容和結果，進一步剔除不符合要求的文獻23 篇（包括結局指標不符的文獻14 篇，主要試驗動物不符的文獻3 篇，敘述性文章5 篇），最終獲得12 篇文獻（包含7 篇中文文獻，5 篇英文文獻），納入Meta 分析。

2.2 納入文章的基本特征 納入12 篇文獻，共包括233只試驗羊。所有納入文獻均提到隨機分組，本研究關注的產出指標為優勢菌群豐度，納入的12 篇文獻中，包含門類水平優勢菌的有10 篇，包含屬類水平優勢菌的有10 篇，文獻信息見表1。

表1 12 篇羊腸道菌群文章信息

2.3 門水平優勢菌豐度 如表2 所示，羊腸道以厚壁菌門和擬桿菌門為絕對優勢門，豐度點估計值分別為56.76%和28.64%，95%置信區間分別為（53.70%，59.81%）和（25.15%，32.13%）。螺旋體門豐度點估計值為2.37%，變形菌門為2.06%，放線菌門為0.69%。

2.4 屬水平優勢菌豐度 羊腸道優勢菌屬豐度及95%置信度區間見表2。擬桿菌屬是羊腸道的優勢菌屬，豐度點估計值為4.33%，95%置信區間為（3.13%，5.53%）。密螺旋體屬豐度點估計值為2.49%，瘤胃球菌屬為1.60%，普氏菌屬為0.67%，丁酸弧菌屬為0.30%。

表2 羊腸道優勢門和屬的meta 分析結果

2.5 發表偏倚評估 如圖1 所示，羊腸道擬桿菌門和厚壁菌門豐度指標漏斗圖對稱性好，P值分別為0.16 和0.90，不存在發表偏倚，其他菌群豐度指標均存在發表偏倚。

圖1 羊腸道優勢門和屬豐度的偏倚評估

3 討 論

因飼料、環境、測序等因素影響，對羊腸道的優勢菌群一直存在爭議，在門水平，多項研究表明厚壁菌門和擬桿菌門均為優勢門前兩位[24-25]，且均落在本研究結果變異范圍內，本研究中厚壁菌門和擬桿菌門的豐度信息不存在發表偏倚，說明結果具有良好的代表性，且該兩個門的微生物在羊腸道中的豐度非常穩健，不易受其它因素擾動。擬桿菌門屬于革蘭氏陰性菌，Parnell 等[26]研究發現擬桿菌門的豐度與體脂和體重呈現負相關，擬桿菌門細菌基因組中富含大量碳水化合物活性酶基因[27]，能夠利用多種膳食可溶性多糖，覆蓋藻類、植物、動物等多種來源的底物，代謝產物以乙酸鹽和丙酸鹽為主[28-29]。擬桿菌門細菌具有多種產維生素和輔酶的基因[30]，可能在羊腸道微生物消化和營養利用中發揮重要作用。厚壁菌門屬革蘭氏陽性菌，利用宏基因組研究發現厚壁菌門細菌富含生物合成及膜轉運相關基因[31]，丁酸鹽產量較高，也能產生多種B 族維生素[32]，幼齡動物攝入固體食物后厚壁菌門細菌豐度逐漸提高[32]，隨著年齡增長，腸道厚壁菌門/擬桿菌門比值顯著升高[33]，厚壁菌門豐度升高可能與抗炎和改善腸道屏障相關[34]，但研究發現過高的厚壁菌門/擬桿菌門比值與2 型糖尿病或肥胖相關[29,35]，羊斷奶后腸道以厚壁菌門類群為主，可能也與年齡增長或機體腸道免疫的建立有關。變形菌門、螺旋體門和放線菌門的優勢地位在各項研究中并不穩定，原因一方面與實驗中使用的羊只數量有限（3～6只）有關[14,24,36-37]；另一方面，可能與這部分菌的發酵特異性有關，受日糧、環境等因素影響較為強烈。變形菌門是細菌中最大的一門，包含著名的機會病原菌，如大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌等[38]，其豐度升高往往伴隨腸道炎癥的發生；大多數變形菌門細菌不是致病菌，也可編碼大量蛋白質和碳水化合物代謝基因，對于維持腸道的厭氧環境起著重要作用[38]。螺旋體門細菌的功能相對研究較少，Ni 等[39]研究發現，飼喂乳酸桿菌和雙歧桿菌制劑能夠顯著提高螺旋體門細菌的豐度。放線菌門雖然占比較小，但其可能在維持羊腸道穩態方面起著關鍵作用，尤其是雙歧桿菌被廣泛用作益生菌制劑[40]。目前為止，人們對不同門水平菌的功能認知還很有限，對于菌間協同或拮抗、細菌與宿主互作等方面均有待深入研究。

擬桿菌屬和普氏菌屬都屬于擬桿菌門，是腸型判定的重要依據，兩者產短鏈脂肪酸的能力差異較大，普氏菌腸型比擬桿菌腸型產丙酸能力高出2～3 倍[41]，這可能與兩者碳水化合物降解酶系不同有關[42]。本研究表明，羊斷奶后以擬桿菌腸型為主，對擬桿菌屬和普氏菌屬進行干預可能實現對羊腸道微生物發酵類型的調控。研究發現，擬桿菌屬的菌株可促進宿主免疫T 細胞的功能完善[43]，還可參與結腸神經元活動的調節[44]，Yoshida[45]發現擬桿菌屬的菌株可以減少腸道微生物脂多糖的產生，有效抑制促炎性免疫反應。而普氏菌可參與宿主免疫調節[46]，與多種炎癥性疾病有關[47]，腸普雷沃氏菌的定植可能加劇宿主腸道炎癥[48]，對羊腸道擬桿菌/普氏菌穩態的調控對機體免疫及健康養殖也具有重要意義。密螺旋體屬的細菌包含致病菌[49]，但密螺旋體屬細菌屬于動物腸道原著菌，是城市化生活的人腸道中逐漸丟失的特殊類群[50]。密螺旋體屬作為羊腸道中的優勢菌，其與羊斷奶后采食的高碳水型飼料密切相關，這與Zhou 等[51]報道的豬腸道密螺旋體屬細菌富含大量多糖降解酶基因的結果相符。瘤胃球菌屬菌株最早在牛瘤胃中被發現，具有降解纖維素的能力[52]，瘤胃球菌屬也富含多種植物多糖水解酶基因[53-54]，在腸道微生態平衡的調節中發揮重要作用[55]。丁酸弧菌是半纖維素降解優勢菌[56]，發酵可產丁酸，淀粉、果膠、木聚糖等多種多糖物質[57]均可作為其底物，其在羊腸道中可能參與降解消化道前端未完全消化的多糖或半纖維素。

本研究經P和I2綜合檢驗顯示納入文獻存在有異質性，原因是：①試驗羊品種和年齡差異；②日糧差異；③羊生理狀態、環境差異。除擬桿菌門和厚壁菌門豐度不存在發表偏倚，其他菌群豐度均存在一定程度的發表偏倚。螺旋體門的偏離值來自于Lin 等[23]在2021 年的報道，對照組使用低精料飼喂湖羊，螺旋體門豐度為27.21%，飼喂高精料后螺旋體門豐度顯著下降至6.97%，這可能由日糧精粗比導致。Thingholm 等[58]研究發現，城市化的生活方式使得人腸道中螺旋體門細菌豐度降低。螺旋體門可能是較易受日糧結構影響的菌群，隨著相關研究的不斷積累，在未來研究中有必要基于日糧不同精補比水平對腸道螺旋體門豐度進行亞組分析，分別評估其水平。密螺旋體屬的偏離值原因同螺旋體門，可能隨日糧精粗比波動較大，其他菌群的偏倚性可能均與研究樣本量的限制等因素相關，未來還需要深入研究加以驗證。

羊腸道細菌群落受宿主遺傳[9]、自身生理狀態[59]、生存環境[60]和日糧結構[5]等因素影響，其中最主要的影響因素是日糧結構[61]，腸道微生物的生長和繁殖歸根結底來自于對營養元素的競爭和消耗[62-63]，本研究結果反映了當前飼養模式下，羊腸道優勢門和屬類別及豐度水平，數據量樣本的擴大突破了試驗研究中樣本量小的限制，基于大樣本分析得到羊腸道優勢門屬類別及合理的豐度參考范圍，為羊腸道微生物結構特征研究和腸道菌群微生態調控提供數據參考，為羊腸道菌群的腸型判定提供理論依據，未來使用大樣本基礎測序數據的重分析細化研究仍有待深入開展。

4 結 論

本研究通過Meta 薈萃分析解析羊大腸腸段的優勢菌群及其豐度參考范圍，結果顯示門水平上，羊腸道細菌優勢門依次為厚壁菌門（Firmicutes）56.76%、擬桿菌門（Bacteroidetes）28.64%、螺旋體門（Spirochaetes）2.37%、變形菌門（Proteobacteria）2.06% 和放線菌門（Actinobacteria）0.69%；屬水平上，羊腸道細菌優勢屬依次為擬桿菌屬（Bacterodies）4.33%、密螺旋體屬（Treponema）2.49%、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）1.60%、普氏菌屬（Prevotella）0.67% 和丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）0.30%，擬桿菌門細菌富含大量碳水化合物活性酶基因，能產多種維生素和輔酶，在羊腸道中發揮重要作用，普氏菌屬和擬桿菌屬均屬于擬桿菌門，是腸型判定的重要依據，羊腸道以擬桿菌腸型為主。試驗結果為羊腸道后端菌群健康調控和科學研究提供了理論依據。