BMP2、HSP27基因在不同地域絨山羊皮膚組織中的表達分布研究

康賽紅，王文義，王國春，朱延旭，賀延玉*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.巴彥勒爾市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥勒爾 015000；3.遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧遼陽 110032）

山羊絨是世界上珍貴的動物纖維，具有潔白、光澤、明亮、纖維柔軟等特點，屬高檔紡織原料，被譽為天然纖維中的一顆明珠[1]。絨毛是次級毛囊產(chǎn)物，次級毛囊為可再生器官，以復(fù)雜可循環(huán)式的結(jié)構(gòu)控制絨毛生長。絨山羊的毛囊發(fā)育分為生長前期、生長期、衰退前期、衰退期、靜止期5 個時期[2]。在毛囊發(fā)育過程中，一系列信號分子在真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞之間相互穿梭，其中包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMP）家族、同源異型框基因（Homobox，HOX）家族、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、熱休克蛋白（Heatshockprotein，HSP）家族等[3]。安國仁[4]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境會影響絨山羊毛囊發(fā)育相關(guān)因子的分布和產(chǎn)絨性能，將遼寧絨山羊引進到四川金川縣后，遼寧絨山羊產(chǎn)絨量與在原產(chǎn)地差異不大，但是羊絨的細(xì)度比原產(chǎn)地細(xì)，說明環(huán)境對絨山羊的絨毛生長性能有一定影響。本實驗主要研究絨山羊次級毛囊發(fā)育相關(guān)基因在不同牧場環(huán)境絨山羊皮膚組織中的表達與定位，探究基因表達與牧場環(huán)境之間的關(guān)系，為絨山羊產(chǎn)絨性能的差異提供組織形態(tài)學(xué)方面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對實現(xiàn)人工調(diào)控絨毛生長及加快絨山羊育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集 實驗動物為來源于遼寧省遼陽市某種羊場的遼寧絨山羊和來自于內(nèi)蒙古巴彥勒爾市某種羊場的內(nèi)蒙古絨山羊，以及由原產(chǎn)地引入到甘肅慶陽市環(huán)縣2 年及以上的2 種絨山羊。分別于2020 年8月采取絨山羊皮膚樣品（2 歲4 只）。采樣部位為體右側(cè)肩胛骨后沿背中線與腹中線的上1/3 處，取1 cm2左右的體側(cè)皮膚固定于4%的多聚甲醛中，切取1 mm2的皮膚組織放入2.5%的戊二醛固定液中備用。再取100 mg 左右皮膚組織放在固定裝有RNA 保存液的凍存管進行短暫保存，之后帶回實驗室-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器 Trizol 法提取所用試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix 購自TOYOBO 公司；PCR Master Mix 購自康為世紀(jì)公司；DL2000DNA Marker、瓊脂糖、6×DNA loading Buffer 購自寶生物工程（大連）有限公司；免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒購自上海生工生物股份有限公司；超凈工作臺、低溫離心機、電泳儀、核算蛋白測定儀、PCR 儀、熒光定量PCR 儀購自濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；轉(zhuǎn)輪式切片機（德國）；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機（常州市中威電子儀器有限公司）；BMJ-Ⅲ型包埋機（常州郊區(qū)中威電子儀器廠）；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；數(shù)碼三目攝像顯微鏡（BA400Digital，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0（美國 MediaCybernetics公司）。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank 上公布的山羊HSP27基因（登錄號：NT_037436.4）、BMP2基因（登錄號：EU854584.1）序列，用Primer Premier5.0 軟件設(shè)計引物，實時熒光定量PCR 擴增，以β-actin為內(nèi)參基因。引物均由西安擎科生物有限公司合成，具體信息見表1。

表1 引物序列

1.4 透射電鏡實驗 取2 歲遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊與引入到環(huán)縣的2 種絨山羊的皮膚組織放入2.5%的戊二醛固定液中固定后，制作大小為70 nm 的超薄切片，鉛染和鈾染之后，在透射顯微鏡下進行拍照觀察。

1.5 總RNA 提取及cDNA 合成 采用Trizol 法提取羊皮膚樣品中總RNA，稱100 g 組織樣品放在預(yù)冷的研缽中進行研磨，成粉末狀后裝入1.5 mL 的無RNA 的離心管中，后續(xù)步驟按照Trizol 法提取步驟進行。所得總RNA 用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性并用核酸蛋白測定儀對其濃度進行測定，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA 合成。

1.6 實時熒光定量PCR 以cDNA 為模板，以β-actin基因作為內(nèi)參基因，采用SYBR 熒光染料方法，對目的基因HSP27、BMP2進行相對定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2 μL，RNase 游離H2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60 s；95℃變性15 s；60℃退火15 s；72℃延伸45 s；共40 個循環(huán)。

1.7 免疫組化實驗 制作石蠟切片，采用免疫組化sp 法染色，過程按照說明書進行，使用 BA200Digital 數(shù)碼三目顯微攝像系統(tǒng)對切片進行圖像采集。

1.8 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 18.0 軟件計算實時熒光定量PCR 重復(fù)樣品間Ct 值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用統(tǒng)計軟件Graphpad Prism5 進行分析作圖，并采用SPSS 18.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，差異顯著為P＜0.05，差異極顯著為P＜0.01；采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的光密度（Integrated optical density，IOD）和面積，并計算每張圖像的平均光密度（Mean Density，MD），使用3 張圖像的平均光密度再計算平均數(shù)，得出每例樣本的平均光密度，使用SPSS17.0 統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 提取結(jié)果 所提總RNA 吸取1 μL 用核酸蛋白測定儀對其純度進行測定，所有樣品的A260/A280值均在1.8～2.0，總RNA 濃度適中，純度較高，完全適合進行下一步實驗。

2.2 透射電鏡結(jié)果 在透射電鏡下發(fā)現(xiàn)（圖1），此時次級毛囊外根鞘進一步增厚，細(xì)胞增大；毛囊內(nèi)根鞘結(jié)構(gòu)層次清晰，赫胥黎層層數(shù)較多，出現(xiàn)亨勒層；毛囊結(jié)構(gòu)較完整，說明此時毛囊處于發(fā)育旺盛時期。

圖1 不同地域絨山羊次級毛囊透射電鏡結(jié)果

2.3 RT-PCR 結(jié)果 由圖2 可知，原產(chǎn)地絨山羊與引入地絨山羊BMP2mRNA 與HSP27mRNA 在同一時期的絨山羊毛囊組織中均有表達，以原產(chǎn)地絨山羊為對照組，遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊引入到環(huán)縣后，HSP27基因表達量在兩地之間差異顯著，但BMP2基因差異不顯著。

圖2 2 歲絨山羊皮膚毛囊中BMP2、HSP27 基因qPCR 表達結(jié)果

2.4 免疫組化結(jié)果

2.4.1 BMP2 蛋白在2 歲原產(chǎn)地與引入到環(huán)縣的遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊皮膚組織中的表達分布 免疫組化DAB 呈色后產(chǎn)物顯示為棕色，深棕色表示強陽性，棕色表示中等陽性，淺棕色表示弱陽性。如圖3 所示，BMP2 蛋白在2 歲原產(chǎn)地與引入地絨山羊皮膚組織中均呈弱陽性表達，BMP2 蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞間質(zhì)、表皮層、次級毛囊的內(nèi)根鞘以及毛乳頭也呈弱陽性表達。

圖3 BMP2 蛋白在不同地域環(huán)境2 歲絨山羊體側(cè)皮膚組織中的表達

2.4.2 HSP27 蛋白在2 歲原產(chǎn)地與引入到環(huán)縣的遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊皮膚組織中的表達分布 通過免疫組化DAB 顯色后發(fā)現(xiàn)HSP27 蛋白在不同牧場環(huán)境絨山羊皮膚組織中都有表達，如圖4 所示，HSP27 蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞間質(zhì)及表皮層中呈強陽性表達，在次級毛囊內(nèi)根鞘、外根鞘、毛乳頭處呈弱陽性表達。

圖4 HSP27 蛋白在不同地域環(huán)境2 歲絨山羊體側(cè)皮膚組織中的表達

2.4.3 BMP2、HSP27 蛋白在不同地域絨山羊皮膚毛囊中光密度值比較 由圖5 可知，BMP2、HSP27 蛋白的光密度值在不同地域存在差異，且2 種蛋白在引入地絨山羊次級毛囊中的平均光密度值都低于原產(chǎn)地絨山羊的平均光密度值。

圖5 BMP2、HSP27 蛋白在不同地域環(huán)境絨山羊體側(cè)皮膚組織中平均光密度統(tǒng)計結(jié)果

3 討 論

毛囊作為哺乳動物唯一像生物鐘的周期性型器官，其發(fā)育受到多種基因分子信號的調(diào)控[5]。HSP 作為一種分子伴侶，在動物毛囊發(fā)育過程中主要起調(diào)節(jié)作用，功能是抑制細(xì)胞的凋亡、保護細(xì)胞等，集中體現(xiàn)在細(xì)胞的生理生化功能方面[6]。HSP27 在皮膚發(fā)育過程中表達從表皮脫落和角化開始，在毛囊中，HSP27 可以在外根鞘最內(nèi)層的細(xì)胞層和突起的角質(zhì)形成細(xì)胞中檢測到。李婷婷等[7]檢測發(fā)現(xiàn)毛囊周期中HSP27 在皮膚的表達量由高到低依次為生長期、退行期、休止期[8]；本實驗發(fā)現(xiàn)HSP27 蛋白高表達于毛囊生長期。賀延玉[9]等對隴東絨山羊毛囊的研究表明，HSP27 在毛囊的毛干和內(nèi)根鞘表達，生長期的表達量高于衰退期和休止期，本實驗發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境下絨山羊毛囊中HSP27 蛋白不但在外根鞘表達，在內(nèi)根鞘、毛乳頭也呈強陽性表達，說明環(huán)境有可能影響其蛋白的表達定位，需進一步驗證。BMP作為毛囊誘導(dǎo)抑制物，對于動物的毛囊形成和發(fā)育具有重要的調(diào)控作用[10]。目前，國內(nèi)外關(guān)于毛囊發(fā)育的研究主要集中在人和小鼠上，BMP 及其受體和BMP 拮抗劑表現(xiàn)出嚴(yán)格的時空表達模式，以實現(xiàn)對表皮和毛囊中細(xì)胞增殖和分化的適當(dāng)調(diào)控[11]。BMP 信號在毛囊（Hair Follicle，HF）形態(tài)變化、毛囊再生和控制HF 周期中起重要作用，通過體外表達BMP4 或靶向滅活BMP 拮抗劑增強BMP 信號激活，導(dǎo)致HF 誘導(dǎo)發(fā)生[12]。外源性BMPs 的相互作用刺激跨膜受體BMPR1A 磷酸化，細(xì)胞外BMP 抑制劑Noggin 通過間充質(zhì)表達，誘導(dǎo)胚胎卵泡形態(tài)發(fā)生，促進新生后HF 生長[13]。BMP2基因是毛囊發(fā)育過程中主要的信號分子之一，本實驗發(fā)現(xiàn)其在不同地域環(huán)境中表達有差異，但主要表達于次級毛囊的內(nèi)根鞘，這與宋亮麗[14]在牦牛毛囊周期性發(fā)育相關(guān)蛋白的研究中獲得的結(jié)果不一致，可能絨山羊與牦牛毛囊發(fā)育有一定的差異性，也可能是由生活環(huán)境改變引起的變化，有待進一步證實。

遼寧絨山羊生活在我國東北，降水量多，氣候溫和，溫差較小，海拔大約在100 m 以下；內(nèi)蒙古絨山羊生存環(huán)境干燥，平均海拔在1 000 m 以上，夏日酷熱，冬季漫長嚴(yán)寒，年降水總量達262.9 mm，年日照數(shù)大于2 700 h；而甘肅環(huán)縣地處西北，空氣干燥，溫差較大，年降水量300 mm 左右，海拔在885～2 089 m，紫外線強。不同的生長環(huán)境對絨山羊的絨品質(zhì)產(chǎn)量有一定影響。張丹[15]對在不同海拔地區(qū)的西藏絨山羊皮膚相關(guān)基因表達研究發(fā)現(xiàn)，高海拔地區(qū)的產(chǎn)絨量整體高于特高海拔地區(qū)，說明地域環(huán)境對絨山羊絨毛生長、產(chǎn)絨量以及影響毛囊發(fā)育核心因子的表達是有一定影響的。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，2 歲遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊從原產(chǎn)地引入到環(huán)縣后，BMP2、HSP27基因在其皮膚組織中的表達定位存在差異，說明改變牧場環(huán)境可以影響絨山羊毛囊發(fā)育相關(guān)因子的表達與定位。