SV40T基因?qū)d羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞體外增殖的影響

汪林麗，艾 越，王夢瑤，張效生，連正興，韓紅兵*

（1.禽畜遺傳改良北京市重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.動物育種國家工程實驗室，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3.農(nóng)業(yè)與農(nóng)村部動物遺傳育種與繁育重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；4.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300112）

子宮是胚胎附植、生長、發(fā)育的搖籃。在行使這些功能的過程中，子宮內(nèi)膜扮演著重要的角色。胚胎附植是成功妊娠的關(guān)鍵步驟，人成功建立妊娠的概率大約只有30%[1]，其中植入異常約占75%[2]，是妊娠失敗的主要原因[3]。對于經(jīng)濟(jì)動物來說，要減少胚胎丟失，提高繁殖力，必須要了解子宮內(nèi)膜生長分化、激素分泌及胚胎附植期間的母胎對話等過程的分子機(jī)制。然而在綿羊中，原代的EECs 和ESCs 只能傳數(shù)代便衰老[4]，無法進(jìn)行大規(guī)模實驗以及基因編輯等操作，給研究帶來了阻礙，因此亟需建立體外可連續(xù)傳代的細(xì)胞株以用于后續(xù)相關(guān)實驗。

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞被阻滯在某一細(xì)胞周期中，同時伴有細(xì)胞形態(tài)、代謝、基因表達(dá)的改變。細(xì)胞周期的阻滯主要受2 個相互關(guān)聯(lián)的途徑控制：p53/p21 和p16/Rb途徑[5-6]。p53/p21 和p16/Rb 途徑的激活導(dǎo)致Rb 激活，從而使細(xì)胞周期阻滯，并最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老[7-8]。因此可以通過靶向這些途徑的關(guān)鍵基因減緩細(xì)胞衰老，甚至達(dá)到永生化。

猿猴病毒SV40 于1960 年發(fā)現(xiàn)，屬真核細(xì)胞病毒，在該病毒中，較大的非編碼區(qū)控制著基因組早期和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)的表達(dá)，在交替剪接后形成大的T 抗原蛋白和小的T 抗原蛋白[9]。SV40T 蛋白可以與p53、pRb 結(jié)合來抑制p53/p21 和p16/Rb 途徑的激活以延長細(xì)胞周期并促進(jìn)細(xì)胞永生。迄今為止，已經(jīng)通過病毒感染、電穿孔、脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染方法介導(dǎo)SV40T基因產(chǎn)生了一系列永生化細(xì)胞系[10-12]。本研究旨在通過SV40T基因建立可供進(jìn)行胚胎附植、子宮發(fā)育等研究的綿羊EECs 細(xì)胞株和ESCs 細(xì)胞株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 取綿羊子宮，用PBS 洗2 遍，用70%的酒精浸泡2 min 后，浸泡在PBS（含200 IU/mL 青霉素和200 μg/mL 鏈霉素）中，并放入冰盒中冷藏保存，盡快進(jìn)行細(xì)胞分離。

1.2 主要試劑 膠原酶III 購自Worthington 公司；胰酶、中性蛋白酶II、DNase I購自Sigma公司；pGMLVSV40T 慢病毒載體購自吉滿生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；基因組提取試劑盒購自美基生物科技有限公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國NEB 公司；SYBR Green 核酸染料購自Qiagen 公司；DMEM/F12、磷酸緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）、雙抗、0.25% 胰酶（含EDTA）均購自Gibco 公司；pan Cytokeratin 抗體和SV40TAg 抗體均購自Santa Cruz 公司；Vimentin 抗體購自Abcam公司；熒光二抗購自Invitrogen 公司；引物均在上海生物工程有限公司合成。

1.3 綿羊EECs 和ESCs 的分離與鑒定 D-PBS 沖洗子宮組織3 遍，剪開子宮，露出子宮腔，將其修剪成合適大小，放入6 cm 培養(yǎng)皿，隨即加入5 mL 含有胰酶（2.5 mg/mL）和中性蛋白酶 II（4.8 mg/mL）的PBS，37℃下消化1 h。去酶，加入適量PBS，室溫下孵育15 min。用蓋玻片輕刮子宮腔面，直至上皮層明顯變少。將液體離心（500 g，10 min）回收EECs 并將其重懸于完全培養(yǎng)基（DMEM/F12，pH 7.4，含10%FBS 和1% 雙抗）。將剩余的組織剪碎，放入10 mL 含Dnase I（200 U/mL）和膠原酶III（1 mg/mL）的PBS，37℃消化1 h，期間顛倒混勻。將消化液用70 μm 的篩網(wǎng)過濾，濾液離心（500 g，10 min）回收ESCs 并將其重懸于完全培養(yǎng)基（DMEM/F12，pH 7.4，含10%FBS 和1%雙抗）。

將細(xì)胞鋪至8 孔載玻片上，待細(xì)胞匯合至70% 左右，棄培養(yǎng)基，每孔加入500 μL PBS，漂洗3 次，加入500 μL 4%多聚甲醛，室溫下固定20 min，加入500 μL PBS，漂洗3 次。每孔加入500 μL 0.5% Triton X-100，室溫孵育20 min，加入500 μL PBS，漂洗3 次。加入500 μL 封閉液，室溫下封閉1 h，加入500 μL 稀釋一抗（EECs 加Cytokeratin 抗 體，ESCs 加Vimentin 抗體，均1:300 稀釋），4℃過夜。次日取出8 孔載玻片，每孔加入500 μL PBS，漂洗3 次，加入500 μL 稀釋熒光二抗（1:300 稀釋），室溫孵育1 h。吸出熒光二抗，加入500 μL PBS，漂洗3 次。加入DAPI 染色液，室溫孵育20 min，吸出DAPI 染色液，漂洗3 次，加入10～20 μL 封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.4SV40T慢病毒載體的感染及單克隆細(xì)胞株篩選 細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞貼壁后，取出慢病毒冰浴融化，用完全培養(yǎng)基將其稀釋成所需濃度（MOI 1:10 或MOI 1:50），將慢病毒載體加入培養(yǎng)液中。48 h 后，棄含慢病毒的培養(yǎng)基，消化細(xì)胞并將細(xì)胞以極低濃度鋪板到大皿中以篩選單克隆細(xì)胞株。將篩選的單克隆細(xì)胞株通過免疫熒光檢測SV40T 蛋白的表達(dá)，將SV40T 陽性的單克隆細(xì)胞株（記為SV40T-EECs 或SV40T-ESCs）用于后續(xù)實驗。

1.5 RNA 提取和RT-PCR 通過RNA 提取試劑盒提取4種細(xì)胞（SV40T-EECs、EECs、SV40T-ESCs 和ESCs）的RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA。設(shè)計SV40T和GAPDH 引物（表1）用于后續(xù)RT-PCR。RT-PCR 體系為cDNA 模板1 μL（約50 ng），10 μmol/L 上下游引物 各1 μL，ddH2O 22 μL，EasyTaq Mix 25 μL。PCR 反 應(yīng)條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，34 個循環(huán)；72℃ 7 min。然后配制20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 SV40T 引物及GAPDH 引物

1.6 血清依賴性檢測 胰酶消化并收集SV40T-EECs（約50 代）和SV40T-ESCs（約30 代），調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL 接種96 孔板，每孔200 μL。培養(yǎng)24 h 后，將原培養(yǎng)液更換為FBS 為20%、10%、5%、0%的培養(yǎng)基，每種濃度設(shè)置4 個重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，去上清，加入90 μL 新鮮培養(yǎng)液和10 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上清液，加入110 μL DMSO 溶液，再放置搖床避光低速震蕩10 min。酶標(biāo)儀測定490 nm 處的吸光值。

1.7 細(xì)胞生長曲線制作 通過細(xì)胞計數(shù)將SV40T-EECs和SV40T-ESCs 以每孔104個細(xì)胞的密度均勻鋪到24孔板中，培養(yǎng)12 h 后開始計數(shù)，每種細(xì)胞每天計3 孔，每孔計3 次，共計7 d。SPSS 軟件擬合生長曲線：細(xì)胞增殖是二分裂生長，因此選用y=a·2b·t模型（a、b 為常數(shù)，t 為細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)），但SPSS 軟件曲線擬合功能選項中無此模型，只有y=a·eb·t模型，因此變換y=a·2b·t=a·eln2·b·t=a·eb·k（k=ln2·t）。輸入培養(yǎng)天數(shù)和細(xì)胞數(shù)量，擬合得到常數(shù)a、b 值，最終得到細(xì)胞生長曲線公式。細(xì)胞倍增時間的計算：Td=Δ t·24h·lg2/（lgNt-lgN0）=24h/b（Td為倍增時間，Δ t 為計數(shù)間隔天數(shù)，Nt為對數(shù)生長期任一點的理論觀察值，N0為對數(shù)生長期理論初始值）[13]。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)品制備、基因組提取以及拷貝數(shù)檢測 擴(kuò)增出SV40T基因部分片段，回收后連接到pMD19-T 載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，并提取質(zhì)粒。用Qubit 4 熒光定量儀測量其濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線模板添加量計算方法：質(zhì)粒為pMD19-T 載體，長度為2 692 bp，SV40TPCR 產(chǎn)物長度為328 bp。MW（平均分子量）=（2 692+328）bp×660 daltons/bp=1.99×106daltons，即1 mol=1.99×106g。1 mol=6.02×1023copies，計算得1 copy=3.31×10-9ng。按照該換算公式得到拷貝數(shù)為102、103、104、105、106、107、108時對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線模板添加量（表2）。提取SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 在MOI 1:10 和MOI 1:50 條件下各3 個細(xì)胞克隆基因組，并通過Qubit 4 熒光定量儀測量其濃度后進(jìn)行qPCR。qPCR 體系為：模板8 ng，上下游引物（10 μmol/L）各1.4 μL，SYBR Mix（Qiagen）10 μL，ddH2O 補 齊 至20 μL。qPCR 反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線模板添加量

1.9 統(tǒng)計分析 本研究通過SPSS 21.0 軟件對血清依賴性檢測采用單因素方差分析，對拷貝數(shù)檢測采用獨立t檢驗。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，P＞0.05 為差異不顯著；生長曲線、血清依賴性檢測結(jié)果、標(biāo)準(zhǔn)曲線均用GraphPad 7.0 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 原代綿羊EECs 和ESCs 的分離與鑒定 通過酶促分離獲得的綿羊EECs 和ESCs，在光學(xué)顯微鏡下，EECs 呈鋪路石狀，簇狀生長；ESCs 呈梭形，分散生長，符合哺乳類動物子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征（圖1）。

圖1 綿羊EECs 和EECs 的分離（100×）

為了進(jìn)一步對這2 種細(xì)胞進(jìn)行鑒定，進(jìn)行了特異性標(biāo)記蛋白（EECs-Cytokeratin，ESCs-Vimentin）免疫熒光染色，結(jié)果顯示這2 種細(xì)胞均表達(dá)其標(biāo)記蛋白（圖2），這些結(jié)果證明成功分離了綿羊的原代EECs 和ESCs。

圖2 綿羊ESCs 和EECs 的特異性標(biāo)記蛋白免疫熒光鑒定（100×）

2.2 SV40T 慢病毒載體感染原代綿羊EECs 和ESCs為了進(jìn)一步得到可連續(xù)傳代的EECs 和ESCs，通過慢病毒pGMLV-SV40T 以MOI 1:10 和MOI 1:50 感染原代EECs 和ESCs 并進(jìn)行單克隆細(xì)胞株篩選。得到的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行SV40T 免疫熒光染色，結(jié)果顯示SV40T 蛋白正常表達(dá)并定位在核內(nèi)，未感染的細(xì)胞呈陰性，并且無論是MOI 1:10 還是MOI 1:50，SV40T慢病毒載體感染效率幾乎達(dá)100%（圖3 和圖4）。

圖3 綿羊EECs 在MOI 1:10 和MOI 1:50 下的SV40T 免疫熒光結(jié)果（100×）

圖4 綿羊ESCs 在MOI 1:10 和MOI 1:50 下的SV40T 免疫熒光結(jié)果（100×）

2.3 長期增殖的SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 細(xì)胞特性將SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 分別連續(xù)傳代到約50代和約30 代后，在光學(xué)顯微鏡下，形態(tài)均與原代細(xì)胞相似，即EECs 呈鋪路石狀，簇狀生長，ESCs 呈梭形，分散生長（圖5）。

圖5 SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 光學(xué)圖片（100×）

對這2 種細(xì)胞SV40T基因的mRNA 表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，SV40T-EECs（約50 代）和SV40T-ESCs（約30 代）均表達(dá)SV40TmRNA（圖6）。

圖6 SV40T-EECs（P50）和SV40T-ESCs（P30）SV40T 的RT-PCR

為了確定經(jīng)過長期培養(yǎng)的SV40T-EECs 和SV40TESCs 是否保持上皮細(xì)胞特性和基質(zhì)細(xì)胞特性，通過對SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 的特異性標(biāo)記蛋白（EECs-Cytokeratin，ESCs-Vimentin）免疫熒光染色，結(jié)果顯示，SV40T-EECs（約50 代）和SV40T-ESCs（約30 代）仍表達(dá)細(xì)胞角蛋白和基質(zhì)蛋白（圖7），說明經(jīng)過長時間的傳代，SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 仍保留了其上皮特性和基質(zhì)細(xì)胞特性。

圖7 綿羊SV40T-ESCs 和SV40T-EECs 的特異性標(biāo)記蛋白免疫熒光結(jié)果

為了確定SV40T-EECs（約50 代）和SV40T-ESCs（約30 代）是否具有癌細(xì)胞的特性，對這2 種細(xì)胞進(jìn)行了血清依賴性檢測，結(jié)果顯示，5%FBS、10%FBS 和20%FBS 與0%FBS 相比，均可明顯提高SV40T-EECs和SV40T-ESCs 的 分 裂 增 生；10%FBS 與5%FBS 相比，促進(jìn)SV40T-ESCs 分裂增生的效果差異顯著，促進(jìn)SV40T-EECs 分裂增生的效果差異不顯著；20%FBS 與10%FBS 相比，促進(jìn)2 種細(xì)胞增殖效果差異顯著，與5%FBS 相比，促進(jìn)細(xì)胞增殖效果差異極顯著（圖8）。這提示對于SV40T-EECs（約50 代）和SV40T-ESCs（約30 代），血清是促進(jìn)其生長的重要因素，即SV40TEECs 和SV40T-ESCs 具有血清依賴性。

圖8 SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 血清依賴性檢測

2.4 生長曲線和拷貝數(shù)檢測 接下來進(jìn)一步對SV40TEECs 和SV40T-ESCs 進(jìn)行細(xì)胞生長曲線的繪制（圖9）。取其中的對數(shù)生長期（3 d、4 d、5 d）通過SPSS 軟件進(jìn)行生長曲線擬合，計算得到SV40T-EECs 和SV40TESCs 生 長 曲 線 公 式 為y=0.286×20.847x（R2=0.909）和y=0.462×20.886x（R2=0.954），由此計算得到倍增時間分別為28.3 h 和27.1 h。

圖9 SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 的細(xì)胞生長曲線

接下來進(jìn)一步進(jìn)行了SV40T基因的拷貝數(shù)檢測，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程式為：回歸方程式y(tǒng)=-0.2957x+11.641，軟件分析得出直線回歸相關(guān)系數(shù)R2=0.995 4，所有標(biāo)準(zhǔn)品的Ct 值基本在一條直線上，沒有任何一個標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)大的偏差，表明標(biāo)準(zhǔn)品制備成功（圖10）。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到SV40T-EECs 在MOI 1:10 和MOI 1:50 條件下的拷貝數(shù)為5.12、1.20、3.14和3.07、3.69、12.08（表3），通過t檢驗，SV40T-EECs在MOI 1:10 和MOI 1:50 的拷貝數(shù)差異不顯著（P=0.373）；SV40T-ESCs 在MOI 1:10 和MOI 1:50 條件下的拷貝數(shù)為3.80、2.31、5.37 和3.95、10.68、3.22，通過t檢驗，SV40T-ESCs 在MOI 1:10 和MOI 1:50 的拷貝數(shù)差異不顯著（P=0.449）（表4）。

表3 綿羊SV40T-EECs（8 ng）SV40T 拷貝數(shù)

表4 綿羊SV40T-ESCs（8 ng）SV40T 拷貝數(shù)

圖10 實時定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討 論

Narayanan 等[14]用SV40 基因建立了牛子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系；Samalecos 等[15]用端粒酶基因建立了人的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系；Bai 等[16]通過HPV E6 和E7基因和hTERT 基因建立了牛的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系，但對于綿羊在國內(nèi)還沒有子宮相關(guān)的細(xì)胞系，因此本研究建立的這2 種細(xì)胞株對于研究綿羊及其他反芻動物的子宮內(nèi)膜功能有重要意義。本實驗中首先分離出了綿羊EECs 和ESCs，并且原代EECs 呈鋪路石狀，呈簇狀生長；原代ESCs 呈梭形，分散生長，符合哺乳類子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的特征。后來通過細(xì)胞角蛋白和波形蛋白免疫熒光染色鑒定證明了分離的EECs 和ESCs 都表達(dá)其標(biāo)記蛋白，表明了分離的細(xì)胞的正確性。在得到這2 種原代細(xì)胞后，為了能獲得連續(xù)傳代的細(xì)胞株，本研究進(jìn)行了慢病毒pGMLV-SV40T 的感染。實驗結(jié)果表明無論是MOI 1:10 還是MOI 1:50，SV40T基因的整合率接近100%，說明慢病毒對EECs 和ESCs 具有較高的感染率和基因整合能力。

在感染了慢病毒pGMLV-SV40T 后，SV40T-EECs能夠傳代50 代以上，SV40T-ESCs 能夠傳代30 代以上，由于原代EECs 只能傳到3 代左右即退化凋亡、空泡化嚴(yán)重[17]，ESCs 也只能傳到8～10 代[4]，證明SV40T基因確實有效地延長了細(xì)胞傳代次數(shù)。另外檢測了SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 在經(jīng)歷長期傳代后的形態(tài)學(xué)特征、SV40T 的RNA 表達(dá)、特異性標(biāo)記蛋白染色、血清依賴性檢測、生長曲線。SV40T-EECs（約50 代）和SV40T-ESCs（約30 代）從形態(tài)上看與原代細(xì)胞相似，并且在RNA 水平上仍表達(dá)SV40T，另外對這種細(xì)胞進(jìn)行特異性蛋白染色均為陽性，證明連續(xù)傳代后SV40TEECs 和SV40T-ESCs 仍保留其上皮細(xì)胞特性和基質(zhì)細(xì)胞特性。由于在感染了SV40T 慢病毒載體后，細(xì)胞快速增長，因此進(jìn)行了血清依賴性檢測，以確定這2 種細(xì)胞是否有癌化的可能，結(jié)果顯示這2 種細(xì)胞均具有較強的血清依賴性，與惡性增殖的癌細(xì)胞不同。這些結(jié)果證明成功地建立了EECs 和ESCs 細(xì)胞株。

從生長曲線可以看出，SV40T-ESCs 總體而言比SV40T-EECs 細(xì)胞增長得更快，這也符合成纖維細(xì)胞類型的細(xì)胞比上皮類細(xì)胞生長得更快的一個普遍特點。進(jìn)一步檢測了SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 這2 種細(xì)胞的拷貝數(shù)，在MOI 1:10 和MOI 1:50 下，SV40T拷貝數(shù)差異不顯著，說明在MOI 1:10 和MOI 1:50 下，SV40T基因在這2 種細(xì)胞中的整合并沒有顯著性差異。

在本研究中通過SV40T 慢病毒載體感染綿羊EECs和ESCs，能夠讓原代EECs 和ESCs 傳到50 代和30 代以上，SV40T-EECs 傳了8 個月以上，SV40T-ESCs 傳了3 個月以上，成功地延長了綿羊EECs 和ESCs 的體外增殖次數(shù)，給綿羊及反芻動物子宮方面的相關(guān)研究提供了材料，解決了因細(xì)胞傳代次數(shù)不夠而導(dǎo)致不能進(jìn)行規(guī)模化細(xì)胞實驗以及基因編輯等操作的問題，能夠推動綿羊及反芻類經(jīng)濟(jì)動物胚胎附植以及子宮等方面相關(guān)研究進(jìn)展。

4 結(jié) 論

本實驗成功分離了原代的綿羊EECs 和ESCs，通過SV40T 慢病毒載體感染原代綿羊EECs 和ESCs，SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 能夠分別傳到50 代和30代以上，成功地延長了綿羊EECs 和ESCs 的體外增殖次數(shù)，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。