山羊AMH和AMHR2基因多態性及其與產羔數關聯分析

李昆諭，劉玉芳，陶 林，江炎庭，歐陽依娜，儲明星*，洪瓊花*

（1.云南省畜牧獸醫科學院，云南昆明 650224；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056001；3.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業農村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193）

山羊（Capra hircus）又稱夏羊，是人類最早馴化的家畜之一[1]。山羊為人類提供肉、奶、皮、毛等主要生活資料，在人類農業文明和經濟發展中起著重要作用。產羔數在繁殖性狀中的權重為74%～96%，影響山羊產羔數的因素有很多，且山羊的產羔數是一個遺傳力較低（0.1 左右）、受多個基因控制的復雜的閾性狀，因此，傳統的育種手段在短時間內難以快速改良[2-3]。近年來，分子標記技術日趨成熟，其具有準確度高、可操作性強、可以縮短育種時間、節約育種成本等優點，能快速、高效地對山羊產羔性狀進行改良，并顯著提高該性狀選擇效率，加快育種進程[4]。抗苗勒氏激素（Anti-MüLlerian Hormone，AMH）又稱作繆勒氏管抑制激素（Mullerian-Inhibiting Hormone，MIH）。AMH 由母羊卵巢顆粒細胞分泌，是轉化生長因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族成員之一，高度保守的AMH 蛋白是由2 個相同的70 kDa單體組成的140 kDa 二聚體糖蛋白，位于山羊的第7 號染色體上[5]。1953 年，法國科學家Jost 等[6]在兔子雄性胎兒支持細胞中首次發現了AMH基因，該基因在性別分化過程中可以促使中腎管發育成雄性生殖器官并使繆勒氏管退化。AMH 蛋白主要通過與其特異性結合受體AMHR2 結合后激活并磷酸化TGF-β-1R（ALK2，3，6），從而啟動胞內信號的轉導[7]。此外，這2 種蛋白結合后還激活AMHR1，被激活的AMHR1 將下游Smad 蛋白磷酸化，隨后，磷酸化的Smads 與Smad4結合形成復合物，轉運到細胞核內，進而發揮功能，調節基因的表達。同時，該調控模式也是TGF-β家族基因的主要調控模式[8]。此外，BMP 家族成員也可影響顆粒細胞中AMH的表達，BMP15 蛋白可通過p38/MAPK 信號通路上調AMH的表達，且濃度越大上調影響也越大[9]。BMP4 和BMP6 可顯著提升牛顆粒細胞中AMHmRNA 的表達量[10]，體外培養的牛卵巢顆粒細胞在單獨添加BMP2、BMP6、BMP15 時，可以顯著提高AMHmRNA 的表達量，BMP6、BMP15 也可顯著增加AMHR2基因的表達量[11]。BMP4 可以顯著提升綿羊顆粒細胞中AMHmRNA 的表達量[12]。AMH可作為評估卵巢儲備、預測卵巢年齡的優良分子標記[13-14]，在輔助生殖技術（ART）中，AMH可以用來預測山羊[15]、綿羊[16]的超排反應，用來標記超數排卵和體內胚胎反應，作為預測超數排卵中排卵反應的重要指標[17]。鄭竹清[18]、Lai 等[19]研究表明，AMH在高繁和低繁羊群體中有明顯的差異，AMHR2在高繁殖力組中被強烈選擇。結合本實驗室前期對云上黑山羊（云上黑山羊是以云嶺山羊為母本、努比山羊為父本培育而成的我國第一個肉用黑山羊品種[20-21]）的重測序結果，推測AMH基因和AMHR2基因可能對產羔數有一定影響，本研究旨在分析AMH和AMHR2基因在云上黑山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊群體中的遺傳多態性及其與產羔性能的相關性，以期能夠為山羊的高繁殖力標記輔助選擇育種提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品 共采集768 只山羊（2～5 歲）的血液，其中云上黑山羊544 只、濟寧青山羊133 只、遼寧絨山羊91 只（表1）。本實驗將濟寧青山羊視為高繁殖力群體，遼寧絨山羊視為低繁殖力群體[22-23]。所有實驗用山羊飼養條件環境一致，云上黑山羊擁有至少1 胎產羔數記錄，部分擁有初生窩重和斷奶窩重（3 月齡）記錄，所有羊均采用頸靜脈采血（10 mL/只），使用EDTA-K2抗凝，-20℃保存。

表1 被測山羊品種及個體數量信息

1.2 血液DNA 的提取 實驗山羊使用酚-氯仿法提取基因組DNA，采用Nano Drop 2000 檢測DNA 樣本濃度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量。

1.3 基因分型 采用Sequenom MassARRAY?SNP 分型技術對AMH基因g.89172108T＞G 位點，AMHR2基因g.26334739A＞G、g.26335365C＞T 位點進行檢測，相關引物信息見表2，分型樣品為DNA，每個樣品需要量為20 μL，DNA 濃度為40～80 ng/μL。

表2 引物序列

1.4 統計分析 應用Microsoft Excel 2020 軟件統計山羊AMH基因g.89172108T＞G，AMHR2基因g.26334739A＞G、g.26335365C＞T 位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數（Ne），并進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗。采用IBM SPSS Statistics 19.0 軟件中的單因素方差分析。多重比較采用LSD 法。對山羊基因型與產羔表型數據進行關聯分析，所有數據以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1AMH基因多態性分析 如圖1 所示，AMH基因g.89172108T＞G 位點在云上黑山羊、濟寧青山羊、遼寧絨山羊中均存在TT、TG 和GG 3 種基因型。

圖1 AMH 基因 g.89172108T＞G 位點分型結果

統計高繁（濟寧青山羊）和低繁（遼寧絨山羊）山羊品種中g.89172108T＞G 位點的基因型頻率和等位基因頻率（表3），AMH基因g.89172108T＞G 位點的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達到極顯著水平，且高繁群體的優勢基因型為TG，優勢等位基因為T；低繁群體的優勢基因型為TT，優勢等位基因為T。

群體遺傳學統計表明，AMH基因g.89172108T＞G在云上黑山羊、濟寧青山羊、遼寧絨山羊中均為中度多態（0.25＜PIC＜0.5）。卡方適應性檢驗結果表明，AMH基因g.89172108T＞G 在濟寧青山羊中處于Hardy-Weinberg 不平衡狀態（P＜0.05），在云上黑山羊和遼寧絨山羊中處于Hardy-Weinberg 平衡狀態（P＞0.05）（表4）。

2.2AMHR2基因多態性分析 基因分型結果如圖2 所示。由圖2 可知，AMHR2基因2 個候選位點均存在多態性。測序結果顯示，AMHR2基因g.26334739A＞G位點在云上黑山羊、濟寧青山羊、遼寧絨山羊中均存在AA、AG 和GG 3 種基因型，g.26335365C＞T 位點在高繁群體（濟寧青山羊）中存在CC、CT、TT 3 種基因型，但在低繁群體（遼寧絨山羊）中只存在CC 基因型（表4）。

圖2 AMHR2 基因g.26334739A＞G、g.26335365C＞T 位點分型結果

如表3 所示，AMHR2基因g.26334739A＞G 位點的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達到顯著水平，但g.26335365C＞T 位點的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均不顯著。g.26334739A＞G 位點在高繁和低繁山羊群體中的優勢基因型均為AA，優勢等位基因均為A。g.26335365C＞T 位點在高繁和低繁山羊群體中的優勢基因型均為CC，優勢等位基因均為C。

表3 AMH、AMHR2 基因3 個多態位點在高繁、低繁山羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

由表4 可知，AMHR2基因g.26334739A＞G 在3 種山羊中均為中度多態（0.25＜PIC＜0.5），AMHR2基因g.26335365C＞T 在3 種山羊中均為低度多態（PIC＜0.25）。卡方檢驗表明，AMHR2基因g.26334739A＞G 在遼寧絨山羊、g.26335365C＞T 在濟寧青山羊中處于Hardy-Weinberg 不平衡狀態（P＜0.05），其余位點均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態（P＞0.05）。

2.3 候選位點與云上黑山羊繁殖性能的關聯分析 如表5 所示，所有基因候選位點均對產羔數無顯著影響，所有基因候選位點對初生窩重和斷奶窩重均無顯著影響。

表5 AMH 基因和AMHR2 基因對云上黑山羊產羔性能的影響（平均數±標準誤）

3 討 論

3.1AMH基因與繁殖能力的關系 研究表明，AMH在原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡中的表達達到峰值并選擇優勢卵泡，當優勢卵泡確定，AMH的表達量就會下降，在荷斯坦犢牛、緬因州-安茹牛[12]、母馬[24-25]體內都發現了這個現象，此外，AMH在閉鎖卵泡中不表達[26-27]。AMH主要通過自分泌或旁分泌作用于周邊細胞，主要表達于卵巢顆粒細胞中，同時子宮內膜異位癥腺體中也發現AMH有表達[28-29]。1999 年，Durlinger 等[30]發現相對于野生型小鼠，AMH基因敲除小鼠的原始卵泡募集速度加快，說明AMH抑制了原始卵泡的募集。同時Durlinger 等[31]還發現基因敲除小鼠體內FSH 水平較低，AMH降低了FSH 對卵泡發育的影響程度，此外在體外AMH也會抑制FSH 對腔前卵泡生長的誘導作用。在生長的卵泡中，顆粒細胞的FSH 敏感性在AMH的存在下降低[32]。綜上，AMH在卵巢中的主要作用為抑制原始卵泡募集以防止卵泡儲備的過早耗盡，調節卵泡發育的同時降低腔前和小腔卵泡對FSH 的敏感性以降低FSH 對卵泡發育的誘導作用[33-34]。此外，Seifer 等[35]發現AMH還具有抑制卵泡閉鎖的作用。Chang 等[36]和Grossman 等[37]發現AMH可以通過抑制cAMP 表達使芳香化酶的表達降低，從而抑制FSH 誘導的顆粒細胞雌激素的產生。因此，AMH基因與動物的繁殖能力息息相關，或可作為檢驗動物繁殖能力的一個指標。

3.2AMH和AMHR2基因多態性及其與云上黑山羊產羔數、窩重之間的關系 目前，關于AMH和AMHR2與產羔數之間關系的報道較少，多集中于AMH對原始卵泡募集作用的影響及對FSH 的影響等。本實驗發現，AMH基因g.89172108 T＞G 位點基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達到極顯著水平，TT 基因型在高繁群體和低繁群體中頻率分布明顯不同，因此推測其突變可能對繁殖力產生了一定的影響，還需實驗進一步驗證。群體遺傳學結果表明，AMH基因g.89172108T＞G 和AMHR2基因g.26334739A＞G 在云上黑山羊、濟寧青山羊、遼寧絨山羊中均為中度多態（0.25＜PIC＜0.5），表明這2 個位點在3 個群體中選擇潛力較大，3 個群體的遺傳多樣性較豐富，遺傳變異程度較大。AMHR2基因g.26335365C＞T 在3 種山羊中均為低度多態（PIC＜0.25），說明該位點在3 個群體中選擇潛力較小。關聯分析結果表明，AMH基因和AMHR2基因的所有候選位點對云上黑山羊的產羔數、初生窩重、斷奶窩重均無顯著影響，表明這3 個位點對產羔數及窩重可能都不是關鍵性位點。

4 結 論

AMH基因的突變位點g.89172108T＞G 和AMHR2的突變位點g.26334739A＞G、g.26334739A＞G 均不適合作為云上黑山羊產羔數的分子標記，也不適合作為初生窩重和斷奶窩重的選擇標記。