雄性犏牛不育機制的研究進展

閔星宇，熊顯榮,*，熊 燕，張 賀，郝振宇，李 鍵,*

（1.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川成都 610041；2.青藏高原動物遺傳育種資源保護與利用國家教育部重點實驗室，四川成都 610041）

犏牛是分布于我國青藏高原地區的重要家畜之一，為牦牛與普通牛的雜交后代，主要做肉用、乳用和役用，在藏區占有極其重要的經濟地位。犏牛體格大生長快，在產奶量和產肉量方面均較牦牛具有顯著的優勢[1-2]。相對于牦牛肉和黃牛肉，犏牛肉具有高蛋白、低脂肪等特點，其氨基酸組成、不飽和脂肪酸以及風味物質含量更為豐富[3]。牦牛產奶量低，奶牛又不適應青藏高原高寒低氧的氣候，牦牛和奶牛雜交的犏牛不僅產奶量高，還能耐受高原高寒低氧的惡劣環境[4]，且具有較高的乳品質，犏牛乳制作的酥油中含有更豐富的亞油酸、亞麻油酸等多不飽和脂肪酸[5-6]。盡管犏牛在生產性能、乳肉品質和高原適應性上具有明顯的優勢，但其雜種雄性不育的缺陷無法通過橫交固定優良性狀，嚴重阻礙了雜種優勢的利用。隨著生命科學的快速發展，國內外對雄性犏牛不育機制的研究愈來愈深入，但精子發生是一個極其復雜的過程，至今還沒有解決犏牛不育這一重大科學難題。雜種不育的現象還廣泛存在于近緣物種雜交中，國內外學者對其雜交后代不育的機制都進行了研究，如馬和驢的雜交后代[7]、不同種類狐貍的雜交后代[8]、雞和鵪鶉的雜交后代[9]、家鴨和番鴨的雜交后代[10]。造成雄性犏牛不育的原因有很多，本文主要綜述雄性犏牛生殖系統形態結構差異、犏牛雄性不育的生理機制和分子機制的研究進展。

1 犏牛雄性不育的形態結構變化

造成雄性不育的因素有很多，其中最直接且最容易觀察到的是生殖系統形態結構的變化。犏牛和牦牛的睪丸形態、顏色高度相似，無顯著差異，但犏牛的睪丸重量大小顯著低于牦牛，并且牦牛睪丸白膜上血管多而密集，犏牛睪丸白膜血管稀少、實質發育不豐滿、質地松軟[11]。生精小管為睪丸小葉內細長彎曲的小管，主要由生精細胞和支持細胞組成，是雄性生殖細胞增殖分化和精子發生的場所，生精小管異常會直接影響雄性的生殖力。通過比較犏牛與親本牦牛和黃牛睪丸組織發現（圖1），犏牛生精小管及其上皮發育不良，生精小管高度空泡，粗細不均，有的管壁呈皺縮狀，其基底膜縮小，呈纖維化狀態[12-14]。間質細胞具有重要的激素分泌功能，與牦牛睪丸的間質組織相比，犏牛間質組織成分少，睪丸間質細胞與小管之間有明顯的空隙，間質細胞數量較少、體積小、分布松散、多處于休止狀態并呈巢狀集聚，激素水平低[12]。與犏牛生殖細胞組成相比，雄性牦牛睪丸中豐富的生精細胞分布于從基膜到生精小管腔的各處，管腔內出現圓形的精細胞或延長的精子；而犏牛睪丸中生精小管只含有支持細胞和少數精原細胞，幾乎沒有可識別的生殖細胞或精母細胞，單層生精細胞松散地附著在基底膜上并表現出變性的形態，精原細胞凋亡增多，細胞減數分裂進程受阻于粗線期中期[1,13,15-16]。Shah 等[17]使用STA-PUT 法分離得到犏牛睪丸中的精原細胞和精母細胞，發現犏牛精原細胞和精母細胞直徑顯著小于牦牛和黃牛。Sato 等[18]研究發現，在F1和F2代雜種牛睪丸中精子發生完全停滯，而在部分F3代雜交牛睪丸中顯示精子發生，表明不但F1、F2、F3代雜種公牛可育性具有漸進性，同一世代的不同個體間也表現出差異。綜上所述，犏牛與親本牦牛和黃牛在雄性生殖器官形態大小與發育狀況、睪丸組織的顯微結構與細胞組成上存在差異，這些形態結構上的變化可能是造成雄性犏牛不育的直接原因，而在生殖系統形態結構上分析使犏牛不育的原因可能是犏牛睪丸中與調控細胞周期、細胞增殖和凋亡基因的差異表達。

2 雄性犏牛不育的生理機制

垂體是家畜重要的內分泌腺器官，與下丘腦和性腺構成下丘腦—垂體—性腺軸，垂體嗜堿性細胞受到下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素（GnRH）作用而分泌促黃體素（LH）、促卵泡素（FSH）等促性腺激素。犏牛垂體前葉嗜堿性細胞幾乎不見，促卵泡素細胞細胞核較嚴重分葉，胞漿入核，分泌顆粒少而小，引起分泌FSH不足，從而影響生精小管的發育；而促黃體素細胞與牦牛差異不顯著，促黃體素細胞分泌的LH 使得睪丸間質細胞發育良好，這也解釋了雄性犏牛表現出正常的雄性特征和性行為[19-20]。雄激素和雄激素受體（Androgen Receptor，AR）信號是精子發生所必須的，在產生睪酮和二氫睪酮（DHT）的過程中3β-羥基類固醇脫氫酶（3-β-HSD）和5-α-還原酶2（SRD5A2）等發揮重要作 用。Sato 等[18]檢 測AR、3-β-HSD 和SRD5A2 在 間質細胞中的表達情況，發現雄性犏牛AR 和3-β-HSD 的表達水平與牦牛相比差異顯著，提示犏牛睪丸間質細胞AR 表達降低和3-β-HSD 表達增強可能是導致雄性犏牛不育的原因之一。完整的生理生化過程和正常穩定的內環境才能保證動物生殖功能的正常。綜上所述，雄性犏牛下丘腦—垂體—性腺軸生理生化過程的變化是造成不育的又一原因。

3 雄性犏牛不育的分子機制

隨著近年來分子生物學的快速發展，從基因組、轉錄組、蛋白組和表觀遺傳修飾等多個方面對雄性犏牛不育機制展開研究，從分子層面解釋雄性犏牛不育的機制，極大地推動了雄性犏牛不育機制的研究。

3.1 雄性犏牛不育相關基因表達調控的研究 雄性犏牛不育候選基因的功能及表達水平變化如表1 所示。哺乳動物Y 染色體雄性特異性區域（MSY）的基因拷貝數變異和表達失調會影響雄性生殖力。Zhang 等[21-22]對比牦牛、犏牛和F2代雜種牛睪丸特異性蛋白Y（TSPY）、熱休克轉錄因子Y（HSFY）、鋅指蛋白280BY（ZNF280BY）、黑色素瘤優先表達抗原Y（PRAMEY）的基因拷貝數和多個MSY 基因的表達水平發現，雄性犏牛和F2代雜種公牛TSPY、HSFY、ZNF280BY和PRAMEY的基因拷貝數顯著大于牦牛，犏牛TSPY、ZNF280BY、HSFY、PRM1和PRM2在睪丸中的表達水平顯著低于牦牛和黃牛。Zhang 等[22]檢測黃牛、牦牛和犏牛睪丸中Y 染色體X 簡并區10 個基因的表達水平，發現Y 染色體上普遍轉錄的四肽重復序列（UTY）、Y 染色體連鎖的口面指綜合征1 基因（OFD1Y）和Y染色體連鎖的泛素特異肽酶基因（USP9Y）的高表達可能與雄性犏牛不育有關。Das 等[23]根據Y 染色體在哺乳動物基因組中的序列信息和位置對牦牛12 個MSY基因進行了鑒定和分析，結果顯示牦牛和黃牛MSY 之間的序列不匹配可能導致雄性犏牛減數分裂重組失敗。

表1 雄性犏牛不育候選基因的功能及表達水平變化

無精子癥缺失基因（DAZ）家族是在生殖細胞中特異性表達的參與控制減速分裂的基因，非靈長類哺乳動物DAZ 家族包括DAZL和BOULE。Zhang 等[16,24]實驗表明，b-DAZL和b-BOULE在睪丸中特異性表達，犏牛睪丸中的表達水平顯著低于牦牛睪丸，證明b-DAZL和b-BOULE 可能是牦牛正常生育時配子發生的關鍵調節因子。Liu 等[25]檢測犏牛DAZL的mRNA 的表達水平并得到了一致的結果。Li 等[26]鑒定到牦牛BOULE的兩種選擇性剪接變異體，分別命名為b-BOULE1和b-BOULE2，發現b-BOULE和b-BOULE1的mRNA 轉錄水平在牦牛睪丸中顯著高于犏牛，b-BOULE2差異不顯著。DAZ 家族基因在犏牛睪丸中的差異表達和b-BOULE基因部分選擇性剪接變異可能是犏牛不育的原因之一。

Huang 等[27]研究發現，犏牛睪丸中有8 個乳酸脫氫酶C（LDHC）剪接變異體，LDHC的mRNA 表達水平顯著降低，表明選擇性剪接可能對睪丸中LDHC 的表達起到一定的調節作用，這可能是雄性犏牛不育的原因之一。PIWI 樣蛋白1 基因（PIWIL1）的缺失可能導致反轉錄轉座子的過度表達，精子發生停滯造成雄性不育。Gu 等[28]檢測PIWIL1和長散布元件-1（LINE-1）反轉錄轉座子mRNA 在黃牛、牦牛和犏牛睪丸中的表達，發現犏牛PIWIL1的低表達影響了轉座子沉默機制，導致雄性犏牛不育。Liu 等[29]研究發現，熱休克蛋白27（Hsp27）/蛋白53（P53）在不同發育階段的牦牛和犏牛睪丸中表達不同，認為雄性犏牛Hsp27 的低表達和P53 的高表達可能調控牦牛和犏牛睪丸發育和精子凋亡。此 外，IGF2[30]、SYCP3[31]、Vasa[32]、Dmrt7[13]和Prdm9[15]等基因在犏牛睪丸中的低表達也可能是雄性犏牛不育的原因。

3.2 轉錄組學在雄性犏牛不育機制上的研究 隨著二代高通量測序技術的發展，以RNA-seq 為代表的轉錄組學技術在雄性犏牛不育發生機制中的研究也越來越多，研究人員分別從信使RNA（mRNA）、小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）等方面展開對雄性犏牛不育機制的研究，并篩選得到可能與雄性犏牛不育的候選基因和非編碼RNA（表2）。

表2 轉錄組學在雄性犏牛不育上的研究

曾賢彬等[33]首次采用高通量測序技術對犏牛和牦牛睪丸組織轉錄組測序和比較分析，得到了9 089 個在犏牛睪丸中顯著差異表達基因（5 000 個上調，4 089 個下調），推測Syce3、Fkbp6、Dmrt7、Spo11、Dmc1、survivin、Bcl-2、Crem等基因的下調和促凋亡相關基因的顯著上調導致了雄性犏牛不育。Cai 等[12]利用RNA-seq 分析鑒定了犏牛與牦牛睪丸組織中2 960 個差異表達基因（679 個上調，2 260 個下調），發現STRA8、NLRP14上調與犏牛睪丸組織中未分化精原細胞的積累和細胞的嚴重凋亡有關，而下調的SPP1、SPIN2B和PIWIL1基因與細胞周期進程和精原細胞基因組的完整性有關，此外許多參與減數分裂的基因也下調。隨后的研究中得到了犏牛和牦牛睪丸組織更高分辨率的轉錄圖譜，篩選得到6 477 個差異表達基因（2 919 個上調，3 558 個下調），發現未分化精原細胞的標記基因和凋亡調控基因在犏牛中上調，而分化維持基因下調，在精原細胞有絲分裂中大多數與有絲分裂檢查點和細胞周期相關的差異表達基因下調，此外幾乎所有與聯會復合體組裝和減速分裂相關的差異表達基因在犏牛中沒有表達[11]。Zhao 等[34]對犏牛和牦牛附睪進行轉錄組測序分析，發現犏牛和牦牛附睪轉錄圖譜顯著差異，鑒定到3 008 個差異表達基因（1 645 個上調，1 363 個下調），許多差異表達基因與精子成熟、運動、宿主防御以及附睪管腔中離子的調節密切相關。

小RNA 是一類非編碼單鏈RNA，包括microRNA（miRNA），小內干擾RNA（endo-siRNA）和Piwi相互作用RNA（piRNA），能夠參與調控動物精子發生[35]。Xu 等[36]利用RNA-seq 技術篩選出61 個差異表達miRNAs，推 測bta-miR-135a、bta-miR-378 和btamiR-184 的下調可能導致犏牛精原干細胞數量減少，bta-miR-34b/c 和bta-miR-449 的下調可能導致犏牛有絲分裂到減數分裂的過度失敗。在隨后的研究中，Xu 等[1]采用STA-PUT 速度沉淀法從黃牛、牦牛和犏牛睪丸中分離得到精原細胞和精母細胞并進行轉錄組測序，鑒定出27 個差異表達miRNAs，推測bta-let-7 家族、btamiR-125 和bta-miR-23a 的下調削弱視黃醛誘導精原細胞的分化，精原細胞轉染分析發現bta-miR-449a 在犏牛中的下調阻礙雄性生殖細胞從有絲分裂向減數分裂的轉變。Wang 等[37]使用RNA-seq 技術得到牦牛、犏牛和黃牛睪丸中miRNAs 和piRNAs 的轉錄圖譜并進行聯合分析，在黃牛與犏牛組、黃牛與牦牛組和牦牛與犏牛組中，共篩選得到119、14、6 個差異表達miRNAs 以及893、1 065、1 158 個piRNAs。Zhang 等[38]利 用RNA-seq 技術檢測牦牛、犏牛和黃牛piRNA 產生的差異，發現在犏牛睪丸中前粗線期源于長散布重復序列的piRNAs 增加，前粗線期源于短散布重復序列的piRNAs 減少，推測粗線期piRNAs 生產中斷是導致雄性犏牛精子發生阻滯的原因之一。

LncRNA 是長度大于200 nt 的非編碼RNA，在動物精子發生中發揮重要作用[39]。阿果約達等[40]采用RNAseq 技術對3～4 歲成年犏牛和牦牛睪丸組織進行轉錄組測序，篩選出6 178 個差異表達lncRNAs（2 470 個上調，3 708 個下調）；篩選得到差異lncRNAs 的候選靶基因2 676 個，其中靶基因PTGDS、IGF2、MEST、GLIS3、NOTCH2、HOXA10、HOXA11與雄性犏牛不育相關。有研究人員用1 歲齡犏牛和牦牛睪丸組織進行轉錄組測序分析，篩選得到604 個差異表達的lncRNAs（469 個下調，135 個上調），生物信息學分析發現這些差異lncRNAs 的靶基因參與犏牛生精細胞的生長、增殖和分化過程等重要的生物學過程，表明這些差異lncRNAs 的異常表達可能導致雄性犏牛生精阻滯[20]。

3.3 蛋白質組學在雄性犏牛不育機制上的研究 隨著蛋白質組學技術的發展，同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術由于其獨特的優勢而被廣泛用于定量蛋白質組學研究[41]。Sun 等[42]使用iTRAQ 技術測定犏牛10、12 和14 月齡睪丸組織中蛋白質的差異，發現10 月齡與12 月齡有318 個差異表達蛋白，10 月齡與14 月齡有327 個差異表達蛋白，而12 月齡與14 月齡蛋白表達差異不顯著，提示犏牛生精阻滯可能發生于12 月齡左右。Yu 等[14]使用iTRAQ 技術比較分析犏牛和牦牛睪丸組織中的蛋白質，篩選出256 個差異表達蛋白，鑒定出10 種可能與犏牛生精抑制有關的蛋白，發現大量的蛋白可能通過增強細胞黏附力來阻止生殖細胞的遷移同時造成精子發生過程中的代謝紊亂，推測犏牛睪丸中生殖細胞的代謝紊亂及其有害微環境是精子發生阻滯的原因。Yang 等[43]使用高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法（LC-ESI-MS/MS）從犏牛和牦牛睪丸蛋白質組中也鑒定到465 個差異表達蛋白。

3.4 表觀遺傳學在雄性犏牛不育機制上的研究 表觀遺傳學是指DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑和非編碼RNA 調控等非遺傳物質改變所致的基因表達水平變化。大量研究發現，大量與精子發生相關的基因在犏牛睪丸中的低表達與其基因啟動子或基因本體的高甲基化有關，如DAZL[21,44]、PIWIL1[28]、SYCP3[31]、Vasa[32]、boule[45]、Mei1[46]、FKBP6[47]等。Li 等[48]報道了印跡基因H19 在犏牛睪丸中的表達量顯著高于牦牛和黃牛，同時檢測到犏牛H19 基因印跡控制區（ICR）的第3 個CCCTC 結合因子（CYCF）位點明顯甲基化，推測H19 ICR 中CTCF 結合位點的印跡失調與雄性犏牛生精障礙有關。Zhang 等[38]的實驗結果表明，犏牛睪丸PIWI/piRNA 途徑中PIWIL1、DDX4、PLD6、MAEL、FKBP6、TDRD1和TDRD5基因啟動子高甲基化影響粗線期piRNA 產生，導致犏牛精子發育阻滯。Shen等[49]比較了牦牛與犏牛睪丸中2 種賴氨酸脫甲基化酶（KDM1A、KDM4B）的表達情況并檢測了H3K36me3和H3K27me3 的組蛋白甲基化修飾情況，發現犏牛睪丸中KDM1A和KDM4B的mRNA 和蛋白質水平的表達以及H3K36me3 水平顯著下降。檢測犏牛和牦牛睪丸中組蛋白甲基轉移酶的表達和組蛋白甲基化分布，結果表明組蛋白甲基化在犏牛生精失敗中具有潛在的作用[50]。Yin 等[51]報道了組蛋白去乙酰化酶1 基因（SIRT1）在犏牛和牦牛睪丸中的生物學作用，認為犏牛睪丸組織中SIRT1 缺乏導致SIRT1 的輔助因子類固醇生成因子1（SF-1）失活和睪丸發育受損。

綜上所述，通過目前對雄性犏牛不育分子機制的研究，得到大量差異表達的候選基因和非編碼RNA，其功能主要與調控細胞分裂、生殖細胞分化、細胞增殖和凋亡相關。雄性犏牛生精小管中的生精細胞能夠分化至精母細胞，但過去的研究主要是籠統地以整個睪丸組織作為研究樣本，以犏牛精原細胞和精母細胞作為研究對象進一步篩選驗證與精子發生相關的差異表達候選基因可能更好解釋雄性犏牛精子發生阻滯的分子機制。

4 結 語

目前對雄性犏牛不育機制的研究成果頗豐，研究人員從組織水平、生理水平、基因組、轉錄組、蛋白組和表觀遺傳學等多個方面都取得了進展，篩選鑒定了一批在犏牛睪丸中差異表達的基因、lncRNA、小RNA 和蛋白質，但很少從細胞和動物水平驗證其在犏牛雄性不育中的作用機制。新一代測序技術的快速發展和測序價格的降低有助于更加準確、更加全面地鑒定出與雄性犏牛不育相關的候選基因。在未來的研究中，可以建立犏牛雄性生殖干細胞系，使用干擾和過表達技術，從細胞水平驗證候選基因、lncRNA 和小RNA 在雄性犏牛不育中的作用機制，然后進一步通過動物實驗來驗證雄性犏牛不育的候選基因、lncRNA 和小RNA。隨著對雄性犏牛不育研究的不斷深入，對雄性犏牛不育機制的認識將會更加準確全面，并找到解決雄性犏牛不育問題的方法。