嚙齒動物卵泡顆粒細胞凋亡的研究進展

方振宇，任 娟，全炳榮，金花子

（延邊大學農學院，吉林延吉 133000）

細胞凋亡（Apoptosis）是指機體為了維持自身內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制細胞發(fā)生自主且有序的死亡過程[1]。與細胞壞死不同，細胞凋亡是機體為了更好地適應新的生存環(huán)境所進行的死亡過程。細胞凋亡主要的形態(tài)變化為細胞濃縮，染色體DNA 被以核小體為單位切成梯狀片段，細胞縮小，形成細胞凋亡小體，凋亡小體再通過細胞膜表面以出芽的方式脫落，最終被附近的吞噬細胞所吞噬[2]。

卵巢作為雌性動物重要的生殖腺，其主要功能是生產卵細胞以及分泌雌激素。在雌性動物的生殖周期中，99%以上的卵泡都會發(fā)生卵泡閉鎖從而退化，而僅有不到1%的卵泡能夠發(fā)育至成熟[3]，絕大部分的卵泡會發(fā)生閉鎖，而卵泡閉鎖的實質就是細胞凋亡[4-5]。本文綜述了細胞凋亡的過程與調控機制，并對影響嚙齒類動物卵泡顆粒細胞凋亡的因素進行分析，為揭示細胞凋亡機制的理論奠定基礎，進而有助于畜牧業(yè)動物快速擴繁。

1 細胞凋亡的過程與調控機制

1885 年Flemming[6]研究卵巢卵泡細胞時發(fā)現了一種與細胞壞死不同的細胞死亡現象，并在1887 年將這種細胞死亡現象稱為染色質溶解死亡。1972 年澳大利亞生物學家Kerr 等[7]在電鏡下觀察到有別于細胞膨脹、崩潰等細胞壞死的典型性狀，而是以細胞核濃縮、細胞內DNA 斷裂等現象為特征的細胞死亡，其推測這種細胞壞死的死亡機理肯定和普通的細胞壞死不同，有可能是機體自身基因控制的一種死亡，因此將這種死亡現象稱為“細胞凋亡”。

細胞凋亡過程可分為4 個階段：凋亡信號轉導、激活凋亡基因、執(zhí)行凋亡、清除凋亡細胞。其機理是凋亡誘導因素與細胞受體經生化作用后形成死亡信號并激活凋亡相關基因，半胱氨酸蛋白酶（Caspase）進行活化反應并激活核內部的核酸內切酶及Caspase-3，降解細胞內的蛋白質，致使細胞死亡，最后凋亡的細胞由吞噬細胞分解[8]。造成細胞凋亡的相關基因主要有Caspase家族、Bcl-2家族及腫瘤壞死因子受體超家族等，其中Bcl-2家族與生殖細胞凋亡最為密切。

迄今為止，被科學所證實的細胞凋亡信號通路共有4 種[9]：凋亡受體信號通路、線粒體通路、內質網信號通路、Caspase 非依賴的細胞凋亡途徑。

1）凋亡受體信號通路。凋亡受體是一類跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子超家族的一員，常見的受體有Fas、TNFRI、DR3，其對應的配體為FasL、TNF、Apo-3。細胞外的凋亡配體與細胞膜上的凋亡受體特異性結合，并進入細胞內部，Caspase-8、Caspase-10 等被細胞內的天冬氨酸特異性刺激后產生一系列的生化反應。死亡受體聚合之后，導致接頭蛋白的結合并激活Caspase 的級聯(lián)反應。

2）線粒體通路。線粒體不僅是細胞能量的代謝中心，還是細胞內源性凋亡信號誘導的細胞凋亡中心，所以也將線粒體通路稱為內源性凋亡。線粒體在細胞功能強的區(qū)域廣泛分布。線粒體造成的細胞凋亡包括3 種機制：①電子傳遞、ATP 產生的破壞及氧化磷酸化；②激活并釋放Caspase 家族蛋白；③最為直接的方法是改變細胞氧化還原的能力。在凋亡因素刺激下線粒體跨膜電位消失，導致膜的通透性發(fā)生變化，細胞色素C（Cyt-c）釋放并與dATP、活化因子-1（Apaf-1）、pro-Caspase-9 結合形成凋亡小體，激活Caspase-9，最終造成細胞凋亡[10]。研究證明[11]雖然細胞的凋亡途徑有多種，但外源性（凋亡受體）途徑和內源性（線粒體）途徑是主要的凋亡過程，且均由Caspase 家族介導。

3）內質網信號通路。內質網通路的發(fā)現要比前面兩者稍晚一些，它和細胞凋亡之間的關系主要在于：①對鈣離子的作用；②內質網的應激反應；③內質網上的Bcl-2基因家族參與細胞凋亡。內質網是細胞內蛋白質合成的主要場所，同時也是Ca2+的主要儲存庫。內質網Ca2+平衡破壞或者過度積累造成位于內質網膜的Caspase-12 的表達，進而激活Caspase-9，自噬相關蛋白被切斷，最終導致細胞凋亡（圖1）。

圖1 細胞凋亡通路圖[13]

4）Caspase 非依賴的細胞凋亡途徑。通常情況下，凋亡誘導因子（AIF）存在于線粒體內膜，受到凋亡信號刺激時，AIF從線粒體轉移到細胞質內，然后進入細胞核中，引起核內DNA 的聚集，并最終導致大量DNA片段的斷裂，造成細胞凋亡[12]。

2 影響嚙齒動物卵泡顆粒細胞凋亡的因素

卵泡顆粒細胞凋亡的主要原因是卵泡閉鎖。嚙齒動物卵泡顆粒細胞凋亡的機制十分復雜，造成的原因也很多，主要分為內在因素和外在因素。

2.1 內在因素 激素、細胞因子等內在因素是影響卵泡顆粒細胞凋亡最主要的因素，通過促進或抑制凋亡因子對其進行調控。

2.1.1 激素 激素以對細胞特有的方式在其存在或消失的狀態(tài)下引起細胞凋亡，并通過對細胞發(fā)生免疫反應的程度進行調節(jié)，以維持機體平衡[14]。大部分激素對顆粒細胞的凋亡發(fā)揮抑制作用。體內研究表明，小鼠中促卵泡激素（FSH）表達可以在mRNA 水平上抑制3-硝基丙酸（3-NP）誘導的細胞凋亡和P53 上調的凋亡調控因子（PUMA）的表達；在體外實驗中發(fā)現，FSH 可以在mRNA 水平上抑制過氧化氫（H2O2）誘導的細胞凋亡和PUMA的表達，證明FSH 能夠抑制顆粒細胞的凋亡[15]。這與牛生長激素在小鼠卵巢細胞當中過表達的結果相似[16]，相比于正常小鼠其卵泡凋亡率顯著降低16%，而排卵前的健康卵泡也比正常小鼠顯著高3.1%，表明牛生長激素能夠減少卵泡的閉鎖率，進而增加排卵數。但并不是所有的激素對顆粒細胞凋亡具有抑制作用，Danilovich 等[17]對腦切除并經過雌激素處理的大鼠進行GnRH 類似物（Leuprolide Acetate，LA）注射，之后通過原位末端轉移酶標記技術對表現出DNA 片段化的細胞核進行免疫細胞化學定位，結果表明在所研究的所有時間（注射LA 的1、2、4 或7 d），經過LA 處理過的小鼠其卵泡顆粒細胞凋亡數量增加。總之，大部分激素通過抑制細胞凋亡而對卵泡顆粒細胞的生長起促進作用。

2.1.2 細胞因子 細胞因子作為細胞外的環(huán)境因素影響卵泡顆粒細胞的凋亡，也可分成抑制凋亡和促進凋亡兩類[18]。胰島素樣生長因子-I（IGF-I）作為抑制細胞凋亡的細胞因子對卵泡影響較深，Chun 等[19]收集大鼠排卵前卵泡，進行有無類IGF-I 體外對照培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h 后發(fā)現對照組凋亡DNA 片段增加，而IGF-1 組能夠自發(fā)地抑制顆粒細胞的凋亡作用。而轉化生長因子（TGF）在卵泡中發(fā)揮的作用與IGF-I 有所不同，體外實驗證明，TGF-α和TGF-β1只存在其中1 種因子時對顆粒細胞沒有影響，但它們同時存在的情況下，會協(xié)同導致大鼠顆粒細胞的凋亡[20]。此外，還有其他細胞因子對顆粒細胞凋亡起著促進作用，如溫鑫等[21]發(fā)現Zhangfei 因子在小鼠卵泡發(fā)育及閉鎖過程中均有表達而且參與調控卵泡的發(fā)育及閉鎖，證明Zhangfei 不僅能促進內質網的應激，還能夠抑制ERK1/2 的磷酸化，促進卵巢細胞的凋亡。Choi 等[22]研究表明Krüppel 樣因子4（Klf4）過表達會通過下調Bcl-2 基因的水平增加排卵前大鼠顆粒細胞的敏感性，從而使顆粒細胞凋亡的比例升高。

凋亡是一種通過細胞內促凋亡基因和抗凋亡基因的共同調控，激活凋亡基因，最終誘導細胞凋亡的過程。例如Bcl-2家族基因，與細胞凋亡最密切相關的基因之一，在凋亡中起著重要作用。屈麗華[23]通過對大鼠不同發(fā)育時期卵細胞生長研究發(fā)現，Bcl-2/Bax基因對其卵泡細胞的發(fā)育和凋亡有重要的調節(jié)作用，且卵泡閉鎖及卵泡中不同細胞的凋亡機制與調控方式隨卵巢不同發(fā)育時期、卵泡不同發(fā)育階段而異。而汝文文[24]也通過實驗證明了在大鼠卵巢顆粒細胞凋亡中Bcl-2/Bax基因的比例越大細胞就趨于存活，反之則更趨于凋亡。除Bcl-2基因家族外，Caspase 家族也在細胞凋亡中發(fā)揮至關重要的作用。多囊卵巢綜合征（PCOS）的大鼠卵巢組織中Caspase-3 的mRNA 水平比正常大鼠高，是因在其發(fā)病過程中NF-κB 通過正向誘導Caspase-3 的表達，誘導顆粒細胞凋亡[25]。

2.2 外在因素 除內在因素外，環(huán)境污染物、輻射等一些外在因素也影響嚙齒動物卵巢功能障礙，最終損害生殖系統(tǒng)[26]。

2.2.1 環(huán)境污染物 環(huán)境中許多有害物質會通過不同的凋亡途徑誘導顆粒細胞的凋亡。盛菲等[27]使用不同濃度的多環(huán)芳烴（PAHs）對小鼠卵巢進行體外培養(yǎng)，結果顯示隨著濃度增加卵泡數量減少，隨后通過免疫組化法證明PAHs 可通過干預Caspase-3、Caspase-9 和Bcl-2/Bax基因表達來促進卵泡凋亡，進而影響卵泡功能。Loretta 等[28]對大鼠進行4-乙烯基環(huán)己烯二環(huán)氧化物（VCD）80 mg/kg·d 的腹腔注射，并在隨后的時間點評估動物的生殖性能時，發(fā)現隨著時間的推移，VCD 組中的周期性被破壞，導致其誘導大鼠卵泡破壞與卵巢早衰。同樣，將小鼠卵巢暴露于全氟丁烷磺酸鹽（PFBS）（≥200 mg/kg·d）中，PFBS 通過降低甲狀腺激素水平致使卵泡顆粒細胞和卵丘細胞Akt-mTOR 信號下調，最終導致卵泡發(fā)育和卵巢激素生物合成障礙[29]。由此得出，環(huán)境中存在著一些有毒物質影響卵泡顆粒細胞的正常生長。

2.2.2 植物提取物 植物中的一些物質含有毒素，會直接影響包括卵巢在內的生殖系統(tǒng)，引起卵泡顆粒細胞的凋亡。郭毅煒等[30]將斷乳至成熟期間的大鼠持續(xù)暴露于不同濃度赤霉素（GA3）時，結果顯示在低、中、高劑量GA3 組的有腔卵泡數量與對照組相比有所下降，而閉鎖卵泡數量上升。這與用棉酚培養(yǎng)大鼠卵巢的結果一致，實驗表明在卵泡發(fā)育的所有階段，用棉酚處理過的大鼠卵泡數量明顯少于正常卵巢卵泡數量，證明棉酚會促進卵泡閉鎖[31]。趙煜等[32]對注射5 mg/kg 玉米赤霉烯酮（ZEA）的大鼠卵巢顆粒細胞中Fas 及FasL 的動態(tài)變化表達進行檢測，結果顯示出總的上升趨勢，推測ZEA 可能通過上調Fas/FasL 來促進卵巢顆粒細胞凋亡。

2.2.3 有機化合物 除了有毒物質，一些無毒性的有機化合物也會對卵泡顆粒細胞的正常生長造成損傷，引起卵泡閉鎖。郝麗[33]使用不同劑量的乙醇對大鼠進行灌胃時發(fā)現，隨著乙醇灌胃劑量的提升，大鼠卵巢顆粒細胞凋亡程度逐漸加深，濃度6%～7%乙醇可能是細胞凋亡的分界點，一旦超過這個分界點就會引起凋亡卵泡和黃體的比例顯著升高。鄰苯二甲酸單酯（MEHP）的暴露影響大鼠卵巢顆粒細胞凋亡相關基因的表達水平，通過上調Caspase-3、Caspase-7 蛋白水平并降低Bcl-2 蛋白水平，從而降低大鼠卵巢顆粒細胞的存活率[34]。此外，雷公藤甲素一方面通過抑制AKT 等信號通路、上調凋亡相關因子Caspase-3促進大鼠卵巢顆粒細胞的凋亡，另一方面增加了大鼠卵巢顆粒細胞自噬小體以及自噬溶酶體數量，進而達到抑制卵泡發(fā)育的目的[35]。

由上述3 個外在因素可知，環(huán)境中存在的一些化學物質通過各種凋亡通路或直接或間接的影響卵巢的生殖功能，最終誘導卵泡顆粒細胞的凋亡。

2.2.4 輻射 目前，環(huán)境中輻射對人類的影響日益增加，因此對于它的研究也受到廣泛關注。Lee 等[36]使用鈷-60源，總劑量為7.2 Gy（戈瑞），劑量率為12.0 cGy/min的γ射線平均致死劑量（LD 50）對青春期前小鼠進行全身照射，在照射前的第0 d 和照射后的第1、2 和3 天，收集卵巢并評估形態(tài)變化發(fā)現，γ射線誘導小鼠卵巢卵泡的凋亡和變性。通過對不同狀態(tài)下手機輻射對雌性小鼠生殖功能和應激反應的影響時發(fā)現，暴露于輻射下的小鼠發(fā)育和成熟卵泡以及黃體的數量明顯減少，垂體促性腺激素、性腺類固醇的血清水平和類固醇生成因子-1（SF-1）、類固醇生成急性調節(jié)蛋白（StAR）以及孕酮的表達水平明顯降低，手機輻射會誘發(fā)應激反應，從而影響雌性小鼠的生殖能力[37]。尉春華等[38]將在s 波平均密度分別為20 mW/cm2的高功率微波輻照實驗組大鼠10 min，40 mW/cm2輻照5 min、10 min 后發(fā)現，其卵巢內部C-myc 蛋白和Bcl-2 蛋白表達升高，而40 mW/cm2組升高更為明顯，推測出高功率微波輻射能夠促進Bcl-2 蛋白以及C-myc 蛋白的活化和表達，進而誘導卵泡細胞的凋亡。

2.2.5 排卵方式 除了環(huán)境因素之外，某些人為因素也可能對卵泡顆粒細胞的生長或凋亡造成影響。陳艷婷等[39]研究不同促排卵方案對小鼠顆粒細胞凋亡的影響時發(fā)現，GnRH-a 和GnRH-ant 排卵方案促進小鼠顆粒細胞的凋亡，而PMSG 排卵方案相比空白組的凋亡蛋白表達有所下降，說明PMSG 方案可以抑制小鼠顆粒細胞凋亡。因此，選擇合適的排卵方案能夠減少卵泡閉鎖數量，有助于顆粒細胞的正常生長。張芳[40]對大鼠卵巢卵泡進行重復超排卵，結果顯示卵泡閉鎖的速度增加，并且隨著超排卵的次數增加閉鎖速度越快。之后進一步研究發(fā)現重復超排卵通過降低卵巢凋亡抑制因子Bcl-2的表達使卵泡閉鎖，并且這種效果隨著超排卵次數的增加其降低的作用越發(fā)明顯[38]，但由于凋亡基因Bax的表達沒有明顯變化，因此尚不能證明重復超排卵導致的卵泡閉鎖是由Bcl-2/Bax所調節(jié)的。通過上述方式對卵泡顆粒細胞的生長和凋亡進行人為調控，是控制動物生產繁殖性能最直接的手段之一。

3 總結與展望

綜上可知，嚙齒動物卵泡顆粒細胞凋亡除了受到體內各種調節(jié)因子的影響外，環(huán)境中的某些物質也可能是造成凋亡的原因。但歸其本質是某些刺激對凋亡基因進行激活和調控，使體內促凋亡基因的表達量增加，進而通過各種凋亡通路致使顆粒細胞發(fā)生凋亡。

細胞凋亡是一個正常的生理過程，對維持內環(huán)境平衡具有重要作用。深入研究卵泡顆粒細胞凋亡的機制，可以調控動物的發(fā)情周期，增加排卵卵泡的數目，從而達到提高受精率及繁殖率的目的,甚至還有助于進一步解析腫瘤以及癌癥的作用機制，為今后的治療打基礎。