氣相色譜-氮化學發光檢測器測定土壤中嗪草酮殘留的方法研究

李鑫圓 呂 平 鄧志華 仇玉萍 鄭 毅,4 孫仕仙

（1. 西南林業大學生態與環境學院，云南 昆明 650233；2. 昆明海關技術中心，云南 昆明 650228；3. 西南林業大學國家高原濕地研究中心/濕地學院，云南 昆明 650233；4. 云南開放大學鄉村振興學院，云南 昆明 650223）

嗪草酮，又稱賽克津，屬三嗪類除草劑，是預防糧谷和豆類等旱田作物領域雜草生長的高效選擇性除草劑[1-2]。據統計，2016年嗪草酮在馬鈴薯、大豆和甘蔗作物上的銷售額占到了總市場的35%[3]。殘留在生物環境中的嗪草酮因其結構上具有3個碳和3個氮對稱排列的六元環結構（均三氮苯環結構），不易被微生物降解，很容易造成土壤環境污染[4-5]。土壤是最大的有機污染物倉庫，這些污染物會通過徑流進入到土壤深處和水環境中，通過食物鏈威脅生態環境和人類健康[6]。嗪草酮被世界自然基金會認定為環境內分泌干擾物，能夠對生物或人體的生殖、神經和免疫系統造成功能損傷，由此可見，環境中嗪草酮的殘留測定方法研究是保障食品安全的重點問題。目前，嗪草酮殘留分析方法主要有氣相色譜法（GC）、液相色譜法（LC）及色譜-質譜聯用技術（GC/LC-MS）。因質譜具有很高的靈敏度和選擇性，已在國標和農殘檢測研究中廣泛使用[7-11]。除質譜外，氣相色譜儀常根據所測物質的不同類別而與不同的檢測器聯用，常見用于嗪草酮殘留檢測的有電子捕獲器（ECD）[12]和氮磷檢測器（NPD）[13]。

氮化學發光檢測器（NCD）是利用檢測樣品中氮化合物和臭氧產生的發光反應，來檢測樣品中的氮含量，從而對樣品進行定量的檢測器。在復雜的基質條件下，NCD對有機氮化合物產生等摩爾的線性響應，不會受到樣品中其他化合物的干擾。現階段NCD檢測器的應用還只存在于對胺、硝基化合物、吡啶和喹啉合成物原材料或中間體等有機氮化合物的檢測[14-20]，將NCD檢測器應用于有機污染物農藥類殘留的檢測還屈指可數[21-22]。例如向章敏等采用GC-NCD建立了快速測定鮮煙葉中苦參堿的測定方法，并利用建立的方法進行了消解動態田間試驗；Sun等建立了用GC-NCD測定水溶液和香根草植物體內撲草凈的方法，說明GC-NCD在分析環境中的痕量含氮農藥存在巨大潛力[22]。現階段對嗪草酮殘留檢測方法的研究主要集中于農產品[23-27]、蔬果[4,28]以及水環境樣品[29-32]，包括土壤環境樣品在內，都需經過復雜的凈化處理過程，來排除基質樣品對其響應的干擾。本研究在綜合考慮土壤基質存在吸附作用和物理化學吸收作用的前提下，選擇V（乙腈）∶V（水）=3∶1作為提取劑，配合考慮基質效應，無需凈化處理，結合氣相色譜-氮化學發光檢測器（GC-NCD）進行殘留測定。以期在現有分析方法的基礎上，建立一種高效、高靈敏度、成本較低的除草劑嗪草酮檢測方法，為環境中嗪草酮的檢測提供更便捷的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器設備

Agilent7890A氣相色譜儀（美國Agilent公司），配有Agilent255氮化學發光檢測器（Nitrogen chemiluminescence detector，NCD）（美國Agilent公司），7683B進樣器（美國Agilent公司），SG8200HDT超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司），TS-211C恒溫搖床（上海天呈實驗儀器制造有限公司），Eppendorf AG高速冷凍離心機，HB10 S96水浴旋轉蒸發儀（IKA公司）。

1.1.2 標準物質和試劑

嗪草酮標準品（純度99.8%，上海泰坦科技有限公司），甲醇（色譜純，德國默克公司），乙腈、無水MgSO4、無水Na2SO4和氯化鈉（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）。

1.2 標準溶液的配制

將購買的嗪草酮農藥標準品，用甲醇溶解并定容制取濃度為1 000 mg/L的嗪草酮農藥標準儲備液，試驗時再用甲醇逐級稀釋制取不同梯度的嗪草酮系列標準溶液，其濃度分別為：2.0、0.5、0.1、0.05 mg/L和0.01 mg/L，儲存于-18 ℃冰箱備用。

1.3 樣品前處理

1.3.1 土壤樣品的制備

供試的土壤樣品為設施土，土壤樣品采集自晉寧區大溝尾村，該區域大量種植無公害蔬菜，海拔2 200～2 648 m，為紅壤性地帶，局部為黃棕壤。經測定，土壤理化性質為：含水量28.37%，土壤有機質含量3.82%，pH為7.64，陽離子交換量（CEC）為21.02 cmol/kg。

采集的土壤樣品風干后去除樹枝、腐葉和石子等雜物，經研碎后過孔徑0.25 mm（65目）篩，密封袋中保存備用。

1.3.2土壤樣品的處理

準確稱取5.0 g待測土壤樣品（精確至 0.01 g），置于50 mL塑料離心管中，加入4 mL超純水浸潤15 min后加入12 mL乙腈，59 kHz高頻超聲提取20 min（清洗池內放入生物冰袋），向離心管中加入2.5 g NaCl振蕩混勻，以6 000 r/min離心6 min，將上清液經無水Na2SO4與無水MgSO4混合填充的漏斗過濾至旋轉蒸發瓶內；向離心管內加入10 mL乙腈重復萃取一次，合并提取液后將旋轉蒸發瓶置于40 ℃水浴蒸發儀中旋轉蒸發至干，用5 mL甲醇分兩次潤洗蒸發瓶，使用連接有0.45 μm有機相濾膜的一次性注射器將潤洗液轉移至2 mL棕色進樣瓶，待測。

1.4 儀器工作條件

色譜條件：Agilent7890A氣相色譜儀，Agilent HP-5MS石 英 毛 細 管 柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm，長×直徑×壁厚），載氣為N2（純度≥99.999%），分流模式為不分流，進樣口溫度280 ℃，進樣量為1 μL，柱流速1 mL/min，柱溫40 ℃保持2 min，25 ℃/min升溫至200 ℃，保持8 min，共運行時間為16.4 min，檢測器溫度為328 ℃。

氮化學發光檢測器（NCD）條件：等離子炬的裂解溫度為1 000 ℃，氧氣流量為10 mL/min，氫氣流量為4 mL/min。

1.5 基質效應

將空白土壤樣品按照“1.3.2”節方法進行前處理，用其提取液作為基質溶液，配制系列基質匹配標準溶液。取基質匹配標準溶液與溶劑標準溶液，分別按照“1.4”節的儀器工作條件進樣測定。以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，分別繪制基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線。

2 結果與分析

2.1 土壤樣品的工藝條件優化

在前期實驗中，使用純乙腈進行目標物提取時，由于無法將樣品完全浸潤，目標物的回收率為60%～70%。當嘗試加水浸潤時，回收率略有提高，這是因為添加的水可與三嗪類化合物競爭形成氫鍵從而阻礙目標物與土壤膠體和腐殖酸的親水區形成氫鍵作用[13]。因此，實驗要求必須使添加的水和農藥可以完全浸潤土壤，又不能過量添加，增加后期除水難度。通過優化乙腈和水的配比，最終確定采用混合液V（乙腈）∶V（水）為3∶1進行提取，從而獲得理想提取效果。

現階段研究已逐漸將超聲波輔助提取替代耗時較長的振蕩提取法，在使用超聲波批量處理樣品時，超聲池溫度過高會影響目標物的穩定性，從而影響回收率。因此，本實驗中使用恒溫搖床對樣品進行恒溫提取，與超聲波輔助提取進行提取效果比較，結果表明：使用搖床和超聲波輔助提取都可以在一定時間內達到提取效果，但是超聲波輔助提取達到良好提取效果所需時間更短，在短時間內就能完成所有樣品的提取。為防止超聲提取過程中溫度過高而影響目標物的穩定性，在超聲池中加入生物冰袋，進行人為降溫，從而避免了上述問題的再次發生。

三嗪類除草劑屬于中等弱極性農藥，應選擇極性中等及以上的提取溶劑進行提取。乙腈極性較強，作為通用性強的提取溶劑，對目標物溶解度大，可在一定程度上節約提取溶劑的使用量；且共提取雜質少，不會干擾目標物的響應。此外還需注意鹽析劑和脫水劑的添加量，所有經過勻漿提取的樣品都應加入適量鹽析劑，將提取溶劑完全脫離水相，使待測樣品達到完全脫水狀態。本實驗在提取時通過優化改進鹽析劑、脫水劑的添加量和過濾方法，幫助乙腈與水有效分離，防止樣品中水分及干擾成分進入提取液，從而達到理想的提取效果[33]。

2.2 色譜條件和升溫程序

色譜條件的優化對分析物的峰形和靈敏度有很大影響，因此了解待測物質的物理屬性，選擇合適的色譜柱和建立準確的升溫程序既是氣相色譜分析的核心，又是物質精確檢出的關鍵所在。

本實驗中的嗪草酮屬于中等極性農藥，因此選擇Agilent HP-5MS石英毛細管柱來進行色譜分析。眾所周知，提高進樣量可以直接增大儀器對目標物的響應值。氣相色譜的進樣量基本在1～2 μL之間，但如果不考慮目標物和進樣溶劑的氣化膨脹體積，盲目提高至2 μL很可能會造成襯管污染，并直接影響目標物定量分析。綜合考慮在1～2 μL進樣條件下的定量結果，選擇1 μL進樣量。

此外，升溫程序參數設置也是影響色譜圖待測物質出峰時間和峰形的關鍵所在，本實驗嘗試了5、15 ℃/min和25 ℃/min 3種情況下的色譜圖出峰情況。三種情況下都可出峰，但考慮到進樣運行時間過長影響實驗效率，經過優化參數，將程序設置為柱溫40 ℃保持2 min，25 ℃/min升溫至200 ℃，保持8 min，共運行時間為16.4 min，可保證色譜圖的良好出峰和精確定量。

2.3 檢測器對嗪草酮的響應及參數優化

氮化學發光檢測器（NCD）依靠“化學發光反應”具有獨特的選擇原理，檢測器天生就具有很強的選擇性。它與硫化學發光檢測器（SCD）依靠專利雙等離子體檢測技術實現了對氮和硫的靈敏效能，常被用于檢測石油、汽油和柴油等基質中的硫/氮分析物[14]。

NCD檢測器的檢測原理可以解釋為：氣相色譜柱流出物進入雙等離子體燃燒室，燃燒室中氫和氧的等離子體將所有氮化合物轉化成一氧化氮。一氧化氮進一步與臭氧反應生成激發態的二氧化氮，化學反應式為：R-N+O2→NO+CO2+H2O；NO+O3→NO2+O2+hγ[34]。激發態的二氧化氮回到基態時，在紅外區（600～3 200 nm）發出光，紅色的光學濾波器可使氮化學發光反應產生的光通過，光的強度與樣品中氮化合物的量成正比。

本實驗對檢測器的裂解溫度和氫氣氧氣流量都進行了優化，裂解溫度的高低可以影響儀器對目標物的響應情況。在925 ℃和975 ℃的情況下，色譜峰會出現嚴重拖尾，影響定量，但溫度過高，又會導致基線不穩，最終確定在1 000 ℃時可以達到最佳狀態。在對氫氣和氧氣流量進行調節時發現，流量過小會導致響應值偏低，而過大會導致基線不穩和噪音值增大，通過優化發現氧氣流量為10 mL/min，氫氣流量為4 mL/min時可得到良好響應效果。

2.4 色譜分析

嗪草酮標準溶液色譜圖見圖1，土壤空白基質樣品及樣品加標色譜圖見圖2，色譜圖表明，在嗪草酮標準組分出峰處無明顯的干擾雜峰，說明本方法的色譜條件及前處理條件選擇合適。

圖1 2.0 mg/L（a）和0.05 mg/L（b）嗪草酮標準溶液色譜Fig. 1 Gas chromatogram of 2.0 mg/L(a) and 0.05 mg/L(b) metribuzin standard solution

圖2 土壤空白基質樣品（a）、2.0 mg/kg（b）和0.01 mg/kg（c）加標樣品的色譜Fig. 2 Gas chromatograms of a blank soil matrix sample(a), 2.0 mg/kg(b) and 0.01 mg/kg(c) spiked sample

2.5 標準曲線與線性范圍

取配制好的嗪草酮系列溶劑標準溶液和基質匹配標準溶液，在建立好的儀器工作條件下進行GC-NCD測定，每個濃度平行測定3次，采用外標法峰面積定量。以標準品的質量濃度（x）為橫坐標、峰面積響應值（y）為縱坐標進行線性回歸。結果表明，嗪草酮質量濃度（x）在0.01～2.0 mg/L范圍內與峰面積（y）呈良好的線性關系，在溶劑甲醇中的線性回歸方程為y=397.22x+4.349 9，相關系數為0.999 4；在土壤中的線性回歸方程為y=573x+3.055，相關系數為0.999 9。

2.6 基質效應

在采用色譜儀器進行農藥殘留分析時，有些樣品存在的基質效應會影響提取液中某些待測物信號的強度，從而影響實驗的準確定量。本實驗參考現有的基質效應測定方法，采用基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線的斜率之比（k）來評價基質效應：當k=1時，表示不存在基質效應；當0.9＜k＜1.1時，基質效應不明顯；當k＞1.1時，表現為基質增強效應；當k＜0.9時，表現為基質減弱效應；若k＞1.5或＜0.5時，則表現為強烈的基質增強或抑制效應。根據“2.5”節的結果計算得出嗪草酮的k值為1.44，說明在本實驗條件下，基質效應對定量結果有增強的影響。可能是由于不經過凈化處理，導致含基質共提物無法避免，會對檢測器NCD的定量有一定的影響，因此，使用外標法基質匹配標準曲線定量來消除基質效應造成的影響。

2.7 檢出限和定量限

2.7.1 儀器檢出限和定量限

根據IUPAC對檢出限和定量限的定義[35]，C1=3·Sd/k，C2=10·Sd/k，其中，C1和C2分別為檢出限和定量限（濃度），Sd為多次空白試驗的標準偏差，k為濃度和響應信號曲線的斜率。將Sd=0.075 8，k=397.22帶入上式，C1=0.000 6 mg/L，C2=0.002 mg/L。

2.7.2 方法檢出限和定量限

所建立方法的檢測限，用基質空白所產生的儀器背景信號的3倍定義方法的檢出限（LOD），該方法的檢出限為0.006 mg/kg，用最低添加濃度定義方法的定量限（LOQ），該方法的定量限為0.05 mg/kg。

2.8 方法回收率實驗

在相同的實驗條件下，對空白土壤樣品進行加標回收實驗，將土壤樣品平均分為15份，添加3個濃度水平的標準溶液，每個濃度重復5次，經過相同的前處理過程，計算加標回收率和精密度。結果顯示，在0.5、0.1 mg/kg和0.05 mg/kg三個添加水平下，平均回收率為105%、116%和90%；5次測定的相對標準偏差（RSD）為2.38%、3.92%和7.76%。

2.9 方法比較

將本方法與現行行業標準方法[36]進行比較，實驗使用Thermo scientific TRACE1310氣相色譜配有ISQ Mass Spectrometer單四極桿氣質聯用儀（GC-MS）作為方法比較的檢測儀器。

2.9.1 色譜和質譜儀器條件

基于嗪草酮為中等弱極性農藥，選擇類似于HP-5MS的TG-5MS石英毛細管色譜柱作為氣相色譜柱，采用全掃描模式（掃描范圍為45～350m/z）和選擇離子監測模式（SIM），通過監測離子82m/z、89m/z、103m/z、198m/z、214m/z，對嗪草酮標準溶液進行定量測定，建立嗪草酮的定量分析方法。可得到10.0 mg/L嗪草酮標準溶液總離子流圖及目標物保留時間（圖3）、目標物全掃描質譜圖（圖4）以及0.05 mg/L嗪草酮標準溶液定性離子掃描色譜圖（圖5）。

圖3 10.0 mg/L嗪草酮標準溶液總離子流圖及目標保留時間Fig. 3 Total ion current chromatograph and retention time of 10.0 mg/L metribuzin standards

圖4 目標物全掃描質譜圖Fig. 4 Ions chromatogram for prometryn in full scan mode

圖5 0.05 mg/kg加標樣品定性離子掃描色譜圖Fig. 5 Characteristic ions chromatograph of 0.05 mg/kg spiked sample

2.9.2數據結果比較

采用10.0、5.0、2.0、0.5、0.1 mg/L和0.05 mg/L的梯度標準溶液和基質匹配標準溶液進行定量實驗。最終得到y=97.754x-8.105 7的標準溶液線性回歸方程，相關系數為0.999 和y=152.38x-31.385的基質匹配標準曲線回歸方程，相關系數為0.996 7。采用“2.6”節的基質效應測定方法，得到k值為1.56。采用“2.8”節中所述的實驗方法計算檢出限和定量限，方法的檢出限0.006 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg。

采用“1.3.2”節中所述的實驗方法進行相同的前處理后，并參照“2.9”節中的實驗方法進行完全相同的回收率實驗。結果顯示：在0.5、0.1 mg/kg和0.05 mg/kg 3個添加水平下，平均回收率為110%、84.6%和110%；5次測定的相對標準偏差（RSD）為5.06%、0.96%和1.14%。

3 結論與討論

本研究將氮化學發光檢測器（NCD）作為實驗氣相色譜分析儀器，依靠檢測器（NCD）的“化學發光反應”原理，建立了一種測定土壤中嗪草酮的研究方法。本實驗的方法學驗證表明該儀器可以靈敏地捕捉氮化合物轉化為的氮化學發光元素，而很少受到基質中其他碳氫化合物的干擾。通過對裂解溫度和氫氣氧氣流量參數的改進優化，使NCD檢測器在農藥殘留檢測領域得到了更廣泛的技術前景。

本研究將優化后的實驗方法與氣相色譜-質譜（GC-MS）進行方法的基質效應比較，兩種檢測器所產生的基質效應值（k）為1.0～1.5，表現為弱基質增強效應，高選擇性的質譜檢測器在同等實驗條件下的抗基質干擾程度并不優于NCD檢測器，說明除了檢測器會受到干擾以外，氣相色譜進樣系統端也會受到基質的影響，在樣品定量檢測中應使用外標法基質匹配標準曲線定量來消除氣相色譜中所受到的基質干擾。

綜合上述結果表明，土壤樣品經乙腈/水混合溶液提取，采用NCD作為檢測器，無需復雜且成本昂貴的凈化過程，所得色譜圖在嗪草酮標準組分出峰處無明顯的干擾雜峰，實驗結果低于國家制定的MRL值（最大殘留限量標準），方法的準確度、精密度和靈敏度較高，且使用的有機溶劑種類、用量較少，能滿足土壤環境中嗪草酮殘留測定的要求，分析結果達到環境中農藥檢測的國家標準。

氣相色譜-氮化學發光檢測器（GC-NCD）可用于土壤介質中除草劑嗪草酮的殘留檢測，采用V（乙腈）∶V（水）為3∶1提取，氯化鈉作為鹽析劑，超聲離心提取。方法的回收率為90%～116%，RSD值為2.38%～7.76%，LOD和LOQ值分別為0.006 mg/kg和0.05 mg/kg，該方法高效且成本低廉，可為嗪草酮在土壤環境中殘留檢測提供新的方法參考。