范方宇 趙國瑜 黃 瑾 李華珊 楊絲蕾
(西南林業大學生命科學學院,云南 昆明 650233)
山茶油中含90%以上的不飽和脂肪酸[1-2],且含多種對人體有益的活性成分[3-4],被廣泛應用于食品[5]等領域。但茶油中不飽和脂肪酸在加工、運輸及貯藏中會發生氧化變質,導致營養成分流失[6],此外,黏度大、流動性差也大大限制其應用[7]。乳液又稱乳狀液,是保存茶油等脂溶性成分的常用方法之一,是將一種或多種液體以液滴形式分散于另一種與之不相溶的液體中,由連續相與分散相組成,構成外觀不透明、乳滴粒度小的多相分散體系[8]。研究發現,乳液的遞送系統不僅可保護、攜帶和釋放生物活性物質[9],同時油脂在乳化后界面面積增大,利于與消化液作用,具有較高環境耐受性,還可以提高親脂性化合物在介質中的生物利用度。乳液尺度均一、黏度低等特點,對易揮發、氧化、水解的油脂成分具有保護作用,目前在食品領域顯示出廣泛的應用前景[10]。殼聚糖(CS)是自然界唯一帶陽離子的堿性多糖,是一種天然生物高分子聚合物,具有獨特的功能、營養和理化性質,同時具有良好的吸附性、抗菌性、成膜性和生物相容性,可生物降解[11]。因CS可與帶多個負電荷的其他物質發生交聯,當聚電解質吸附在油性核上時,會形成食品級多層,層的形成可通過充當油性核與外部環境間的屏障來增強生物活性成分穩定性和保質期[12]。因此殼聚糖已被用作包裹活性化合物的材料,在食品工業中有著廣闊的應用前景。納米SiO2是一種無毒、無味、無污染的無機非金屬材料,呈三維網狀結構。表面存在大量不飽和殘鍵、不同鍵合狀態的羥鍵,使表面具有因缺氧而偏離穩態的硅氧結構,同時量子隧道效應和體積效應能使其產生游滲作用,可與高分子化合物以化學鍵結合賦予高分子材料特殊性能[13],不僅能改善有機高分子性質,還能增強其穩定性[14-15]。如于欣偉等[16]通過乳液聚合法制得改性納SiO2-丙烯酸酯聚氨酯乳液,通過Zeta 電位等手段對乳液進行了表征,結果表明添加納米 SiO2后,乳液分散均勻,熱分解溫度提高,乳液平均粒徑在納米級,乳液穩定性增強;Shen等[17]采用水性二氧化硅共混法制備聚丙烯酸酯/二氧化硅雜化乳液,延緩尿素的釋放,并且由于彎曲擴散,使硬度提高,降低水蒸氣滲透率,同時,提高了涂層的加工性能,防止了涂層中顆粒團聚。
在食品加工中,過去大部分研究都以蛋白質作為連續相建立食品乳化體系[18],近年來以高分子水溶性物(如多糖殼聚糖、可溶性淀粉)作為連續相的研究引起關注,但國內外研究多集中于單一CS乳液、CS納米Pickering乳液或蛋白與CS間的相互作用。如邱苗等[19]為探究蛋白質與多糖間的相互作用及其復合物乳化性質,以牛血清白蛋白和殼聚糖復合,研究微觀環境下蛋白質與多糖的相互作用機理,探究兩者對水包油型乳液乳化性能的影響。Zhang等[20]將殼聚糖和酪蛋白復合制備乳液,研究了殼聚糖濃度等因素對乳液穩定性的影響,結果表明殼聚糖的存在能有效地提高酪蛋白的乳化活性和乳液的穩定性。Ribeiro等[21]研究殼聚糖和三聚磷酸鹽離子交聯反應制備納米Pickering乳液,從粒徑分布、微觀結構等方面對殼聚糖納米乳液進行了表征。然而對于以CS溶液為連續相并將納米SiO2引入乳液中探究其性質的研究還鮮有報道。
基于此,為了使CS溶液能夠形成更加穩定的乳液,本研究采用茶油為分散相,選用添加量為CS質量分數的1.00%、3.00%、5.00%、7.00%、9.00%的納米SiO2改性CS溶液為連續相,構建O/W型乳液體系,并對CS-納米SiO2復合乳液相關性質和穩定性進行研究。通過乳化活性、乳化穩定性、離心穩定系數、平均粒徑和流變特性分析納米SiO2添加量對復合乳液的形成及對乳液性質和穩定性的影響;采用電鏡和光學顯微鏡對乳液體系的微觀結構和表面形態進行觀察,為CS和納米SiO2在乳液中進一步的研究和制備穩定的O/W型乳液提供參考依據。
納米SiO2(20~30 nm) 舟山明日納米科技材料有限公司;茶油 益海嘉里食品營銷有限公司;殼聚糖(脫乙酰度≥95%) 麥克林生化科技有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS) 分析純。
XINYI-ⅡD超聲波細胞破碎機(寧波新藝超聲設備有限公司);DZKW-D-V型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司);DJ1C-100電動攪拌器(貴州儀器有限公司);FJ200-SH實驗室數顯高速分散均質機(上海瀘析實業有限公司);A10型多功能臺式高速冷凍離心機(昆明倍捷科技有限公司);UV-2600型紫外可見分光光度計(蘇州島津儀器有限公司);TM3000掃描電子顯微鏡(日本HITACHI公司);LA-960V2激光粒度儀(日本HORIBA有限公司);HR 20 Discovery 混合型流變儀(美國TA公司)。
1.3.1 納米SiO2改性
1.000 g納米SiO2→加入200 mL 7 g/L的SDS(80 ℃配制)→調節pH 4.0→85 ℃水浴攪拌6 h→80 ℃蒸餾水5 500 r/min,5 min反離心洗滌至無泡沫→50 ℃干燥24 h→改性納米SiO2→保存。
1.3.2 CS乳液制備
利用超聲波細胞破碎儀將不同添加量的納米SiO2分散于100 mL、1%乙酸溶液中,功率450 W分散2 h,制備納米 SiO2分散液。2.00 g/100 mL CS溶于分散液,60 ℃、450 r/min攪拌40 min,攪拌過程中按CS與油質量體積化1∶1比例均勻滴加茶油,12 000 r/min高速分散均質3 min,制成乳液。
為研究納米SiO2對后續制備茶油乳液的影響,納米 SiO2添加量分別為CS質量分數的0.00%、1.00%、3.00%、5.00%、7.00%、9.00%。
1.4.1 乳化活性與乳化穩定性測定
不同納米SiO2含量乳液的乳化活性指數(EAI)和乳液穩定指數(ESI)測定參考Zhu等[22]并稍加修改。采用比濁法表征樣品乳化特性。各取100 μL乳液,用體積質量分數0.100% SDS分別稀釋100倍。以0.10% SDS溶液為空白對照,波長500 nm測定吸光值A0,靜置30 min后在相同條件下測定吸光值A30。分別通過下式計算EAI和ESI:

式中:N為乳液稀釋倍數;C為濃度 g/mL;φ為油相體積;A0、A30乳液放置0、30 min 后在500 nm處的吸光值。
1.4.2乳液離心穩定性測定
不同納米SiO2含量乳液離心穩定性的測定在Liu等[23]方法基礎上稍加修改。在距離心管底部1 cm處做標記并取50 μL乳液,用0.100% SDS將溶液稀釋100倍,500 nm下測定吸光值A0。在4 500 r/min下離心30 min,在相同位置吸取等量乳液稀釋,測定吸光值A1。乳液離心穩定性(Ke)按照公式(3)進行計算。

式中:A0離心前吸光度值;A1離心后吸光度值。
1.4.3 乳液粒徑測定
通過激光粒度儀測定不同納米SiO2含量乳液的平均粒徑和粒徑分布。設置激光粒度儀參數,校正調零后將乳液緩慢置于樣品區,進行粒徑測定。
1.4.4 乳液流變特性測定
1)靜態流變測定:設定溫度為25 ℃,乳液剪切速率在0.01~1 000 s-1內,記錄相應剪切速率下不同納米SiO2添加量的表觀黏度與應力的變化趨勢。
2)動態流變測定:設定溫度為25 ℃,乳液振蕩頻率在0.01~100 Hz內,記錄相應振蕩頻率下不同納米SiO2添加量儲能模量(G')和損耗模量(G")的變化趨勢。
1.5.1 凍干乳液掃描電鏡分析
乳液表面結構通過掃描電鏡(SEM)進行分析。乳液經冷凍干燥后分別取樣并用導電膠固定于樣品臺,不同納米SiO2添加量的乳液凍干后微觀結構在500倍下進行觀察。
1.5.2 乳液光學顯微鏡分析
通過光學顯微鏡對乳液表面形態進行觀察,取10 μL乳液置于載玻片上并緩慢蓋上蓋玻片避免氣泡產生,固定于載物臺,在100倍下觀察不同納米SiO2含量乳液的形態結構并拍片保存。
乳化活性和乳化穩定性可直接反映乳狀液特性,乳化活性是指形成乳液的能力,乳化穩定性是指形成的乳液保持分散并在一定的時間內未發生油脂上浮或絮凝的能力[24]。由圖1可知,與未添加納米SiO2的乳液相比,添加納米SiO2后,乳液EAI及ESI顯著(P<0.05)提高,但隨納米SiO2含量增加,EAI和ESI均呈現先升高后降低的趨勢。CS乳液EAI與ESI分別為9.29 m2/g和484 min,當添加量為5.00%時,CS-納米SiO2復合乳液EAI和ESI最高,分別為10.36 m2/g和540 min,與CS乳液相比顯著(P<0.05)提高10.37%和10.53%。除9.00%納米SiO2的ESI,所有CS-納米SiO2復合乳液的EAI和ESI均高于CS乳液。這說明納米SiO2的加入能提高乳液活性和穩定性,一方面因CS具有表面多孔性[25],能與納米SiO2形成復合物包裹在油滴表面,使其具有良好的分散性;另一方面在O/W乳液中,相對較大的親水基團被吸附在分子之間,納米SiO2可以嵌入液滴界面,防止沉淀和保持乳液穩定,且納米SiO2質量分數的增加,其在相界面上排列越緊密,油相和分散相間的界面張力減小,同時形成的界面膜強度越大,對液滴保護作用越強[26]。而EAI和ESI降低可能是由于過量的納米SiO2導致形成的液滴分子間構象不穩定,暴露出過多的親水基團,且多于的納米SiO2會積聚,破壞穩定的界面層,導致乳化活性及穩定性降低。結果表明在適量添加范圍,納米SiO2能增強CS乳液的乳化特性,提高其穩定性。

圖1 納米SiO2含量對乳液乳化活性和乳化穩定性的影響Fig. 1 Effects of content of nano-SiO2 on EAI and ESI of emulsion
乳液體系不穩定,在儲存過程中會產生渾濁、液體分層、絮凝等現象。因此,通過加速離心考察乳液的穩定性。以離心穩定性系數(Ke)作為評價乳液穩 定性的指標。研究表明,離心穩定系數越小,乳液的穩定性越高[27]。由圖2可知,未添加納米SiO2乳液Ke為29.70%,隨納米SiO2添加量的增加,Ke呈現先下降后上升的趨勢,納米SiO2添加量為1.00%、3.00%和5.00%時,Ke值都顯著(P< 0.05)低于未添加納米SiO2的乳液,其中納米SiO2添加量5.00%的乳液Ke最低為13.50%,比未添加納米SiO2乳液顯著(P<0.05)降低54.56%。這主要是納米SiO2在形成乳液的過程中為液滴提供了空間穩定性,增加液滴粒子間的排斥力[28-29],防止乳液分層與液滴絮凝。當納米SiO2為7.00%和9.00%時乳液Ke增大且高于未添加納米SiO2的乳液,可能是添加過量時,液滴分散的自由空間相對降低,在離心作用下易發生乳液液滴間的聚結現象。結果表明,適當的納米SiO2能提高乳液的離心穩定性,但過量添加反而會產生不利影響。

圖2 納米SiO2含量對乳液離心穩定性的影響Fig. 2 Effects of content of nano-SiO2 on Ke of emulsion

圖4 納米SiO2含量對乳液粒徑分布的影響Fig. 4 Effects of content of nano-SiO2 on particle size distribution of emulsion
乳液的液滴粒徑與乳液穩定性相關[1],乳液粒徑越小乳液越穩定。也有研究表明,乳液的EAI、ESI 與乳液的平均粒徑有關:乳液平均粒徑越小,乳化性能越好。不同納米SiO2含量下乳液的平均粒徑及粒徑分布如圖3、4所示。隨納米SiO2含量增大,乳液的平均粒徑呈先降低后增大的趨勢,且當納米SiO2增至3.00%時乳液粒徑最小為12.74 μm。但減小不顯著,說明1.00%、3.00%和5.00%的納米SiO2對CS乳液粒徑并無明顯影響。同時CS乳液及1.00%、3.00%和5.00%的CS-納米SiO2復合乳液均呈單峰,粒徑分布范圍窄峰值高,說明乳液是穩定性較好的單分散體系,乳液中分散相分布集中。添加量為7.00%、9.00%時,乳液粒徑顯著(P<0.05)增大,相比于CS乳液分別增加80.96%和85.17%,多余的納米SiO2相互作用加劇了乳滴間的布朗運動,造成乳液的聚結或絮凝,因此乳液的粒徑增大,范圍寬峰值下降,乳液液滴分布呈現不穩定的多峰現象,形成一種多分散體系,均一性變差。與上文2.2乳液EAI和ESI的測定結果基本一致。

圖3 納米SiO2含量對乳液平均粒徑的影響Fig. 3 Effects of content of nano-SiO2 on average particle size of emulsion
2.3.1靜態流變特性
黏度是影響乳化液穩定性的重要因素,通常乳液的黏度越大,越利于乳化體系保持穩定。乳液的流變學性能也與乳液體系穩定性息息相關,圖5a和b為不同納米SiO2含量乳液的表觀黏度和應力。如圖5a所示,在剪切速率0~200 s-1范圍內,CS乳液和CS-納米SiO2復合乳液的表觀黏度隨剪切速率增加而急劇降低。在200~1 000 s-1內表觀黏度隨剪切速率增加緩慢下降,表現出剪切稀釋現象,屬于假塑性流體[29]。一方面CS乳液本身就為一種假塑性流體;另一方面液滴在乳液內是無序分布,并且在一定空間內分子間會發生布朗運動,當剪切速率增大,剪切阻力大到能克服布朗運動,以及CS-納米SiO2間弱鍵產生的綜合效應時,乳液液滴會在剪切場作用下發生位置重排[30],使乳液內的摩擦力減小,黏度下降。如圖5a和b所示,除7.00%和9.00% CS-納米SiO2復合乳液外,隨著納米SiO2添加量增加,乳液表觀黏度和應力增加,且在5.00%的納米SiO2添加量下表現出最大黏度和應力。CS溶液自身就具備較大黏度,在添加適量的納米SiO2后,乳液體系中有足夠的納米SiO2可以吸附在油滴表面并將其包裹住,有利于限制油滴運動,減弱油滴的聚合。另一方面油水界面吸附納米SiO2有利于分子間相互作用,使油滴間相互連接形成較為致密的類三維網狀結構[31],因此黏度增大,更有利于乳化體系的穩定,相反當納米SiO2添加量為7%和9%時,乳液的表觀黏度和應力小于CS乳液,可能是過量的納米SiO2聚集,破壞了乳液的結構化,乳液絮凝空缺,導致部分油未得到乳化。說明加入適量的納米SiO2,有助于提高乳液表觀黏度和應力。但總體上乳液的粘度和應力都較低,乳液呈現流體狀態。與2.2.2乳液 EAI和ESI的測定結果一致。

圖5 納米SiO2含量對乳液粘度及應力的影響Fig. 5 Effects of content of nano-SiO2 on viscosity and stress of emulsion
2.3.2 乳液動態流變特性
乳液的粘彈性可以用儲能模量G'和損耗模量G"來表征,儲能模量G'又代表彈性性質,損失模量G"代表黏性性質[32]。圖6可知,隨著振蕩頻率增加,所有乳液G'和G"都增加。乳液的G'隨納米SiO2含量的增加先增加后減小。CS-納米SiO2復合乳液都高于CS乳液,其中納米SiO2添加量為5.00%時,乳液的G'最大,可能是納米SiO2與CS間的相互作用形成較高的交聯密度和網絡結構,增強了復合乳液的彈性模量。但納米SiO2的添加對乳液損能模量無影響。在振蕩頻率范圍內,除5.00% CS-納米SiO2復合乳液外,所有樣品乳液的G"值都高于G'值。其中0.00%,1.00%和3.00%G'曲線圖不完整是因為部分G'值為負值,無法用對數表示,說明乳液主要表現為液體的黏性特征,具有良好的流動性。當納米SiO2添加量為5.00%時,在初始振蕩頻率增大階段,G'小于G",乳液體系還處于液體特性,主要發生黏性形變,隨振蕩頻率增大,G'與G"相交,交點后G'大于G",乳液呈彈性為主的凝膠結構狀態,主要表現為固體特性,說明說明其內部存在弱凝膠狀結構,增強了乳液的彈性性能從而保證了乳液的穩定性。

圖6 納米SiO2含量對乳液G'和G"的影響Fig. 6 Effects of content of nano-SiO2 on storage modulus(G') and loss modulus(G") of emulsion
通過光學顯微鏡觀察不同納米SiO2添加量下的乳液表觀形態(圖7)。圖7可知,CS乳液與CS-納米SiO2復合乳液液滴分散均勻,呈圓形,粒徑較小,但CS乳液液滴有部分橋連現象,大小不均勻。1.00%、3.00%和5.00%的CS-納米SiO2復合乳液,乳液粒徑雖變化不顯著,但乳液液滴大小分布較均勻,乳液橋連現象減弱。可以看出在合適的納米SiO2添加量下,液滴更穩定,且沒有明顯的聚結。相反,在添加了7.00%和9.00%的CS-納米SiO2復合乳液粒徑增大,乳液液滴大小不均勻,乳液聚結。這是由于在油滴表面過量的納米SiO2受水親和性,脫離油水界面,發生奧斯特瓦爾德熟化,穩定性降低,導致液滴尺寸因聚結而顯著增加[33]。結果表明,添加納米SiO2有利于使CS包裹到茶油表面并形成較小且分散、大小均勻的穩定液滴。

圖7 納米SiO2含量對乳液表面形態的影響Fig. 7 Effects of content of nano-SiO2 on surface morphology of emulsion
為分析乳液經冷凍干燥后微觀結構的變化,用掃描電鏡觀察CS乳液和不同添加量下CS-納米SiO2乳液(圖8)。圖8a為CS乳液掃描電鏡圖,干燥后的乳液由不同形狀的顆粒組成,顆粒不均勻,表面形狀不規則,其從正常的球形變形擠壓成為多邊形,因此有一些顆粒相互粘附。其中深色斑塊代表油,從圖8a可以看出乳液油滴聚集,表明大部分油滴未被包裹在CS中。添加納米SiO2后乳液表面結構發生變化(圖8b-f)。如圖8b-d所示,隨著納米SiO2添加量的增加,顆粒變得分散,粒徑減小,顆粒呈球形,大小均勻,外壁光滑。同時,表面深色斑塊隨納米SiO2添加量增加逐漸減少,一方面是由于納米SiO2能通過自身骨架結構填充形成乳液過程中可能會產生的表面孔隙[34-35];另一方面表明納米SiO2在與CS發生相互作用后,納米結構增強了CS的致密性,這證實用納米SiO2比單獨用CS具有更高的茶油保護效果。當添加量為7.00%和9.00%時(如圖8e、f),粒徑增大,出現深色斑塊,表明過量的納米SiO2反而破壞了所形成的網絡結構。

圖8 納米SiO2含量對乳液微觀結構的影響Fig. 8 Effects of content of nano-SiO2 on microstructure of emulsion
脂溶性成分可通過乳液等方式進行保護,而形成乳液的穩定性也與連續相材料及添加的復合材料比例有關,多糖類殼聚糖在醫學等領域可降低膽固醇、預防和控制高血壓吸附重金屬還具有一定的免疫效果,同時殼聚糖優良的生物相容性和可降解等使其在生物活性化合物的包封方面應用廣泛[12],還能抑制細菌活性,更好的保護脂溶性等成分延長保質期。邵穎[12]通過乳化超聲制備的殼聚糖-丁香酚乳液保護丁香酚,掩蓋不良風味和異味,減少因蒸發造成的損失,且防止丁香酚與其他食品基質成分發生強烈的相互作用,增強丁香酚的穩定性,改善丁香酚的低水溶性、高揮發性和弱穩定性。此外,包封的活性物質的物理穩定性在納米尺寸狀態下得到極大改善。在抗氧化實驗中,殼聚糖-丁香酚納米顆粒表現出抗氧化效果,在體外緩釋實驗中,實現丁香酚的可控性釋放。殼聚糖-丁香酚納米乳液對革蘭氏陽性和陰性菌均表現出優異的抗菌性,且抗菌性優于游離丁香酚,證明其抗菌性能在乳化包埋過程中得到提高。而納米SiO2是一種高科技超微細無機新材料,以其粒徑小、比表面積大、表面吸附力強、表面能大、化學純度高、穩定性強等在眾多科學領域內獨具特性,有著不可取代的作用。同時具有的特殊觸變性能明顯改善膜、橡膠等制品的抗拉強度、抗撕裂性,研究表明[15],在10 g阿拉伯膠中添加0.25 g納米SiO2時阻氣性和阻濕性最小,且拉伸強度最大,斷裂伸長量最大,有利于制備包裝材料。FTIR、XRD和DSC表明納米SiO2能增強膜的氫鍵,提高熔融溫度,改善其物理性能。除此之外,納米SiO2可作為液體系統的增稠劑、防沉淀,能有效改善液體的分散性和黏度指數,調節流變性,增強電荷穩定性。
因此,本研究以CS為連續相、山茶油為分散相,制備CS與納米SiO2(1.00%、3.00%、5.00%、7.00%、9.00%) 復合乳化體系,以探究CS與納米SiO2添加量間的相互作用及對復合乳化體系功能性質的影響。結果表明,納米SiO2添加量為1.00%~5.00%時,納米SiO2添加量的增加可使乳液中EAI、ESI、表觀黏度、G和'G"提高,以及Ke的下降,表明乳液穩定性增強。CS-納米SiO2復合乳液表現出典型非牛頓假塑性流體行為。乳液平均粒徑變化不顯著,但乳液粒徑分布窄峰值高。由冷凍電鏡與光學顯微鏡觀察結果可知,隨納米SiO2添加量的增加,表面油滴減少,乳液分布更為均一,形狀規則,呈球狀均勻分布。納米SiO2質量分數為5.00%時,乳液中EAI、ESI最高為10.36 m2/g和540 min,與未添加納米SiO2乳液相比分別提高10.37%和10.53%;Ke最低為13.20%,相比于CS乳液降低了54.56%,乳化性能提高,增強乳液穩定性。乳液粒徑為12.98 μm,表觀黏度最大,G和'G"都增高,乳液向由流體凝膠轉化。納米 SiO2添加量為7.00~9.00%時,乳液EAI、ESI、黏度、G'和G"降低,粒徑顯著增大,由單峰轉化為雙峰且粒徑分布變寬峰值降低,Ke增大,表明乳液穩定性下降,乳液呈流體。乳液粒徑在可視范圍內增大,乳滴分布不均勻,產生不規則的非球狀,對乳液的微觀結構破壞較大,不利于乳液均一。與此同時,部分油滴聚集形成粒徑較大的油滴,這也是乳液粒徑分布變寬的原因。由此可見,在納米 SiO2添加量為5.00%條件下所形成的乳液最穩定,超過5.00%會對乳液穩定性造成不利的影響。表明添加適量的納米 SiO2(1.00%~5.00%) 可改善CS乳液的乳化性質,增強乳液穩定性。同時,與單一CS乳液相比,CS-納米SiO2復合乳液不僅顯著增加理化穩定性,而且采用CS與納米SiO2作為穩定劑制備乳液具備很好的可行性,使用CS作為材料與納米級SiO2形成包裹油滴的乳液所研究的方法適用于食品保護,其良好的穩定性為今后多糖乳液和納米SiO2在食品領域中的應用提供依據和參考。最重要的是,載有CS的納米 SiO2復合乳液可作為更好更有創新的遞送載體,用于提高儲藏食品的貨架壽命和保護。