HLA-G 在口腔黏膜白斑中表達的臨床意義探討

吳平凡，郭凌燕，陳林林，陳蔚華（通訊作者）

（南昌大學附屬口腔醫(yī)院<江西省口腔生物醫(yī)學重點實驗室>口腔頜面外科 江西 南昌 330006）

人類白細胞抗原-G（human leukocyte antigen,HLA-G）屬 于 非 經(jīng) 典HLA- Ⅰb 類 分 子，1987 年 由Geraghty 首次克隆成功[1]。其最早被發(fā)現(xiàn)表達在母-胎界面的絨毛外滋養(yǎng)層細胞，防止母體排斥胎兒，是構成母胎免疫耐受的重要機制之一。有研究表明[2]，HLA-G表達的上調可能是腫瘤逃避免疫監(jiān)視的原因之一。口腔黏膜白斑（oral leukoplakia, OLK）被認為是最常見的口腔癌前病損，有關口腔黏膜白斑中HLA-G 抗原表達情況的研究較少。本研究采用免疫組化技術了解HLA-G 抗原在OLK 中的表達情況，并探討其與白斑病理分級之間的關系。

1.資料與方法

1.1 資料

鼠抗人HLA-G 單克隆抗體（abcam 公司）。通用型SP 試劑盒（北京中杉金橋公司），DAB 顯色劑。

收集2018 年1 月—2019 年12 月于南昌大學附屬口腔醫(yī)院手術切除并經(jīng)病理證實為口腔黏膜白斑病例58 例，其中單純性增生12 例，輕度異常增生15 例，中度異常增生13 例，重度異常增生18 例。正常口腔黏膜標本25 例。OSCC 標本31 例。納入標準：（1）術前口腔黏膜白斑患者未行局部藥物注射治療；（2）術前口腔鱗癌患者未行放化療；（3）手術病理切片保存完整，診斷均由經(jīng)驗豐富病理科醫(yī)師診斷明確。排除標準：排除口腔黏膜白斑局部癌變患者。

1.2 方法

免疫組化采取SP 法對組織切片進行染色。每個標本行4 μm 厚連續(xù)組織切片，常規(guī)行HE 染色，用0.1 g/L磷酸鹽緩沖鹽溶液代替1 抗作為陰性對照。預實驗確定HLA-G 抗體最佳工作濃度為1:100。

結果觀察在10×40 倍光學顯微鏡下觀察組織切片的顯色反應，對每張切片選取5 個不同視野，以細胞膜、細胞質或細胞核呈現(xiàn)棕黃色反應判為陽性表達，由兩位病理學專家在光鏡下判讀結果，陽性細胞表達率M=（陽性細胞數(shù)/記數(shù)細胞總數(shù)）×100%，25%記為-，25%M50%記為+，50%M75%記為++，M75%記為+++。統(tǒng)計時“-”歸為陰性表達，其他皆為陽性表達，且“+”為弱陽性表達“++”、“+++”均歸為強陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。各組HLA-G免疫組化結果與臨床病理參數(shù)的關系采用χ2檢驗。P＜0.05 為有顯著差異。

2.結果

2.1 正常口腔黏膜上皮及口腔鱗癌HLA-G 的表達

HLA-G 在正常口腔黏膜標本中未見表達。31 例口腔鱗癌標本中有21 例(67.74%) 出現(xiàn)了陽性表達，以強陽性表達為主(19/21)，陽性信號可見于細胞膜、細胞核或細胞質中，與正常口腔黏膜組比較有顯著差異(χ2=27.10，P=0.001)，與正常組比較，增生患者表達也有顯著差異（P＜0.05）。(見圖1、表1)。

表1 正常口腔黏膜、口腔黏膜白斑、口腔鱗癌中HLA-G 表達免疫組化結果

圖1 在正常口腔黏膜及口腔鱗癌中的表達（SP×100）

2.2 各病變組口腔黏膜HLA-G 的表達情況及與臨床病理參數(shù)之間的關系

HLA-G 抗原在OLK 中陽性表達率為31.03%（18/58），主要定位于上皮基底層細胞、棘層細胞的胞膜、細胞質或胞核上，呈淺黃或棕黃色著色（見圖2），與正常口腔黏膜組相比具有統(tǒng)計學差異（χ2=9.91，P＜0.05）。隨著異常增生程度的增加，其HLA-G 抗原的表達逐漸增高，以弱陽性表達為主，上皮固有層內(nèi)可見有大量淋巴細胞浸潤。雖然在單純性增生、輕度異常增生及中度異常增生的OLK 組中HLA-G 均見有表達，但其組間比較未見統(tǒng)計學差異（χ2=0.8，P＞0.05）。

圖2 HLA-G 在各級OLK 中的表達

重度異常增生的OLK 中HLA-G 抗原的表達顯著性的高于單純性增生的OLK 組（χ2=7.47，P＜0.01），且以強陽性表達為主。伴有重度異常增生的OLK 中HLA-G抗原的表達和口腔鱗癌未見統(tǒng)計學差異（χ2=0.03，P＞0.05）。

3.討論

口腔黏膜白斑的形成除局部不良長期刺激以外，也與機體免疫功能密切相關，其中最重要的是細胞免疫。免疫細胞監(jiān)控失調是惡性腫瘤產(chǎn)生的必要條件，腫瘤細胞可通過低表達MHC 及共刺激分子，上調抑制性分子等機制抑制免疫細胞的功能，從而躲避人體免疫系統(tǒng)的攻擊。HLA-G 是Paul 等[3]首次在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，自被發(fā)現(xiàn)以來，HLA-G 逐漸進入腫瘤研究者的視線。HLA-G 在多種惡性腫瘤組織中表達程度與腫瘤分化水平、患者生存預后緊密相關[4]。口腔黏膜癌前病變中白斑較常見，有關其HLA-G 的表達是否異常增高的研究尚未見報道。

在本研究[5]中筆者發(fā)現(xiàn)在單純性增生、伴有輕度異常增生及中度異常增生的OLK 中隨著異常增生程度的增加，雖然其HLA-G 抗原的表達逐漸增高，但均以弱陽性表達為主，且固有層內(nèi)可見有大量淋巴細胞浸潤。這些提示筆者OLK 在發(fā)生初期局部免疫系統(tǒng)并未因抑制性分子HLA-G 完全破壞，相反黏膜下固有層內(nèi)出現(xiàn)大量淋巴細胞反應性增生，這些非特異性免疫細胞使得局部免疫能力可能出現(xiàn)反應性增強，后期隨著病變發(fā)展又逐漸減弱。口腔鱗癌HLA-G 抗原的表達顯著高于正常口腔黏膜組，與以往的研究相符。伴有重度異常增生的口腔黏膜白斑中HLA-G 抗原的表達顯著性的高于其他OLK 組，且以強陽性表達為主。筆者認為可能在白斑發(fā)展的后期，局部微環(huán)境可能存在刺激HLA-G 產(chǎn)生的各種細胞因子，如IL-1β, IL-10，IFN-γ，及TGF-β 等。

本實驗從蛋白表達水平檢測了HLA-G 抗原在口腔黏膜白斑中存在有表達增高的現(xiàn)象，尤其在伴有重度異常增生時，其增高與異常增生的水平有關。筆者先前研究已證實MHC-I 類抗原于口腔黏膜白斑中存在一定程度的表達降低。由此可見口腔黏膜白斑的產(chǎn)生是選擇了MHC-I表達陰性克隆的結果，同時HLA-G 的異常表達使得不僅逃避了特異性細胞毒性T 淋巴細胞的監(jiān)視，而且抑制NK細胞的防御機制，共同營造了一個免疫抑制微環(huán)境，使得白斑逐漸向癌變方向發(fā)展。