法尼醇受體通過下調miR-21水平抑制非小細胞肺癌細胞增殖及侵襲能力

王振華陳金亮邢媛媛郭喜喜李東飛

(1.新鄉市中心醫院胸瘤二科，河南 新鄉 453000；2.南通市第一醫院呼吸科，江蘇 南通 226006)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要類型，死亡率高[1]。目前，NSCLC根治性切除術后5年的總生存率仍低于15%[2]。因此，有必要探索NSCLC的分子機制，尋找新的治療靶點。法尼醇受體(Farnesoid X receptor，FXR)是核受體超家族的成員，能對管腔膽汁酸水平進行嚴格調控[3]。由于大約70%的膽汁酸被人體重新吸收，FXR可以在血漿中達到微摩爾濃度，這可能是許多其他組織中表達FXR的基礎[4]。先前的研究顯示，與癌周非腫瘤組織相比，人類結直腸癌組織中的FXR表達較低，并且FXR低表達與不良預后之間存在關聯[5]。最近的研究報告了FXR可作為腫瘤抑制因子，在體內、體外激活可抑制多種細胞生長[4－5]。然而，其潛在機制并不完全清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一種單鏈非編碼RNA分子，其通過調節癌基因或抑癌基因在抑制或促進腫瘤生長中發揮關鍵作用[6]。研究發現，miR-21在幾種惡性腫瘤中加速癌癥進展，包括胃癌和結直腸癌[7]。此外，miR-21在肺癌中被觀察到上調，并與肺癌侵襲能力增加有關[8]。先前的研究發現，FXR激動劑可以通過抑制miR-21改善非酒精性脂肪性肝炎小鼠的脂肪變性、炎癥、氧化應激和膽固醇積累[9]。然而，關于FXR激動劑能否通過下調miR-21水平抑制NSCLC細胞增殖及侵襲能力尚不清楚。因此，本研究旨在觀察FXR在NSCLC組織和細胞系中的表達水平，探討FXR在NSCLC細胞增殖和侵襲中的作用是否與調控miR-21水平相關。

1 材料和方法

1.1 實驗組織與細胞系

在2010年至2012年間，取本院手術切除的80例NSCLC組織及配對的正常組織。所用患者經病理證實為NSCLC。術前無局部或全身治療。所有組織樣本在液氮中新鮮冷凍，然后轉移到－80℃保存，直到使用。所有患者至少持續隨訪60個月，并收集相關臨床病理特征和生存統計數據。

人NSCLC系(A549、NCI-H1299、H460)和正常細胞系(16HBE)購自美國ATCC。細胞培養在含10%FBS、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中(美國Invitrogen公司)。

1.2 主要試劑與儀器

抗人FXR的初級抗體購自武漢Proteintech公司；TRIpure試劑、Super M-MLV逆轉錄酶、2×Power Taq PCR MasterMix購自北京BioTeke公司；SYBR green、RIPA緩沖液購自北京Solarbio公司；GW3965(FXR激動劑)購自美國Sigma公司(批號:NP1524)，細胞計數試劑盒-8購自日本Dojindo公司；PVDF膜購自美國Invitrogen公司；PVDF膜、lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；β-actin一抗購自英國Abcam公司；雙熒光素酶報告系統購自美國Promega公司；miR-21過表達物或對照質粒pcDNA3.1和miR-21抑制劑或陰性對照siRNA均購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

ExicyclerTM96熒光定量分析儀購自韓國Bioneer公司；BX51顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 腫瘤組織中FXR表達的免疫組化分析

手術標本(NSCLC組織及配對的正常組織)用10%福爾馬林固定，石蠟包埋。將載玻片與抗人FXR的初級抗體在4℃下孵育過夜，后在25℃下與二級抗體孵育1 h。根據染色強度和陽性細胞百分率對每個切片進行評分。染色強度評分如下:0(陰性)、1(弱染色)、2(中度染色)、3(強染色)。陽性細胞百分率評分如下:0(0%)、1(0%~10%)、2(10%~50%)、3(50%~80%)、4(>80%)。IHC評分通過強度和百分率相乘得到。取FXR組織評分中位數作為低表達和高表達判斷:<6，低表達；≥6，高表達。

1.3.2 qRT-PCR分析

使用TRIpure試劑從組織或培養的細胞中提取總RNA。使用Super M-MLV逆轉錄酶將總RNA逆轉錄為cDNA。使用2×Power Taq PCR MasterMix和SYBR green在ExicyclerTM96熒光定量分析儀上進行Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)。使用U6小核RNA(U6 snRNA)作為內源性對照。依據NCBI上登錄的靶基因序列并通過primer 5.0引物設計軟件設計特異性引物序列如下:miR-21，正向5’-GCGGCAGGGGGAAAGTTCTA-3’，反向5’-GTG CAGGGTCCGAGGTATTC-3’；U6，正向5’-TGGAGT TGATCCTAGTCTGG-3’，反向5’-GTGCAGGGTCCG AGGTATTC-3’。經過qRT-PCR后，使用2－△△CT方法計算目的基因的表達變化。

1.3.3 CCK-8法

將A549細胞(5×103)接種到96孔板中，分為:對照組和不同濃度的GW3965處理組。不同濃度的GW3965組加入不同濃度的GW3965(1~5μmol/L)或對照組加入相同體積的二甲基亞砜處理48 h。然后，使用細胞計數試劑盒-8檢測細胞增殖情況。

1.3.4 細胞侵襲試驗

使用Transwell方法進行細胞侵襲分析。將1.3.3項下經不同分組處理的A549細胞以每孔4×105的密度接種到24孔Transwell小室中，并在上室中加入200μL無FBS的培養基。使用500μL含30%胎牛血清培養基填充底部孔。培養24 h后，用70%乙醇處理和0.5%結晶紫染色。在BX51顯微鏡下量化侵襲細胞的數量。隨機選擇五個區域，并在每個區域中統計細胞數。

1.3.5 Western blot分析

用RIPA緩沖液裂解細胞提取總蛋白。通過BCA試劑盒評估蛋白質含量。采用10%SDS-PAGE電泳將蛋白質轉移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后在4℃下用以下一抗封閉過夜:FXR(1∶1000)和β-actin(1∶1000)。將PVDF膜與二抗在室溫下孵育1 h。使用蛋白質印跡檢測化學發光試劑盒觀察目標條帶。

1.3.6 細胞轉染

取A549細胞，以每孔5×104個細胞接種于24孔板。然后用lipofectamine 2000轉染試劑，分別將miR-21過表達物(pcDNA-miR-21，50 nmol/L)或對照質粒pcDNA3.1(pcDNA)和miR-21抑制劑(si-miR-21，100 nmol/L)或陰性對照siRNA(si-NC)轉染入細胞。轉染24 h后，收集細胞并分為8組:pcDNA＋DMSO組、pcDNA＋GW3965組、pcDNA-miR-21＋DMSO組、pcDNA-miR-21＋GW3965組、si-NC＋DMSO組、si-NC＋GW3965組、si-miR-21＋DMSO組、si-miR-21＋GW3965組。將細胞用 5 μmol/L GW3965或DMSO處理0、24、48和72 h，收集細胞進行CCK-8法、Transwell法分析。

1.3.7 雙熒光素酶報告分析

合成含有miR-21靶點的FXR野生型(WT)或突變型(MUT)，然后克隆到pmir-GLO載體中。將1.5μg pmirGLO-FXR-WT或pmirGLO-FXR-MUT分別與pcDNA-miR-21和/或si-miR-21共轉染A549細胞，孵育24 h后，用雙熒光素酶報告系統測定熒光素酶活性。

1.4 統計學方法

使用SPSS軟件17.0進行統計分析。結果表示為平均數±標準差(±s)。使用t檢驗或Mann-Whitney U檢驗評估組之間的差異。使用卡方檢驗、Fisher’s精確檢驗和Kaplan-Meier方法(對數秩檢驗)進行相關分析和生存數據分析。NSCLC組織中FXR與miR-21表達之間相關性采用Spearman相關分析。P<0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 FXR低表達與NSCLC患者預后不良相關

FXR蛋白位于細胞膜上(圖1A)。與鄰近的非腫瘤正常組織相比，FXR在NSCLC組織中的表達顯著降低(P<0.001，圖1B)。80例患者中，有27例FXR高表達，53例FXR低表達。Kaplan-Meier分析顯示FXR低表達預示NSCLC患者預后較差(χ2＝4.496，P＝0.033，圖1C)，提示FXR可能作為一種致癌因子參與NSCLC的發生和發展。研究進一步分析了FXR的表達與NSCLC患者臨床病理特征的相關性。結果顯示，FXR高、低表達的NSCLC在臨床分期、腫瘤大小、T分期和淋巴結轉移(N分期)上有顯著性差異(P<0.05)(表1)。

表1 根據NSCLC中FXR蛋白表達的臨床病理特征Table 1 Clinicopathologic characteristics according to FXR protein expression in NSCLC

圖1 FXR低表達與NSCLC患者預后不良相關Figure 1 Low FXR expression is associated with poor prognosis in NSCLC patients

2.2 FXR抑制NSCLC細胞增殖和侵襲

使用Western blot方法檢測了3種NSCLC細胞系中的FXR蛋白，發現FXR在A549細胞中的表達最低(圖2A)，因此，研究選擇A549細胞用于以下實驗。Western blot顯示，GW3965以劑量依賴方式促進了A549細胞中FXR的表達(圖2B)。功能實驗表明，GW3965以劑量依賴方式顯著抑制了A549細胞的增殖和侵襲(圖2C、D)。所有這些結果表明FXR受體對細胞增殖和侵襲具有很強的抑制作用。

圖2 FXR抑制NSCLC細胞體外增殖Figure 2 FXR inhibited the proliferation of NSCLCcells in vitro

2.3 FXR的激活通過下調miR-21抑制NSCLC細胞增殖和侵襲

使用PCR方法檢測了3種NSCLC細胞系中的miR-21，發現miR-21在A549細胞中的表達最高(圖3A)。利用GW3965激活FXR可劑量依賴性地降低miR-21(圖3B)。功能實驗表明，miR-21過表達顯著逆轉了FXR對NSCLC細胞生長和侵襲的抑制作用(P<0.05)，并且miR-21沉默顯著增強FXR對NSCLC細胞生長和侵襲的抑制作用(P<0.05)(圖3C~H)。為了證實FXR與miR-21之間的關系，研究進行了雙重熒光素酶報告基因檢測。圖4A顯示了分別包含預測的miR-21野生型和突變體結合位點的FXR mRNA的3’-UTR(FXR 3’-UTR WT和FXR 3’-UTR MUT)(帶突變的堿基標有下劃線)。在FXR 3’UTR WT組中，與陰性對照轉染細胞相比，pcDNA-miR-21顯著抑制FXR 3’UTR WT的熒光素酶活性(P<0.001)，si-miR-21可顯著減輕該抑制作用(P<0.01)(圖4B)。這些結果表明，FXR通過靶向miR-21來抑制NSCLC細胞增殖和侵襲。

圖3 FXR通過下調miR-21抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲Figure 3 FXR inhibits the proliferation and invasion of NSCLC cells by down-regulating miR-21

圖4 FXR直接與miR-21相互作用Figure 4 FXR directly interacted with miR-21

2.4 FXR過表達與NSCLC中miR-21呈反相關

研究進一步利用qRFPCR分析了miR-21在同一標本中的表達，以闡明FXR和miR-21在NSCLC中的關系。結果顯示，NSCLC組織中miR-21的水平顯著高于鄰近組織(P<0.01，圖5)。將80例NSCLC組織分為兩組:miR-21高表達組(高于miR-21表達中位數，n＝40)和低表達組(低于miR-21表達中位數，n＝40)。Spearman分析顯示，NSCLC標本中FXR與miR-21的表達呈強負相關(P<0.001，表2)。Kaplan-Meier分析顯示，“FXR低表達”和“miR-21”高表達共存模式預測了NSCLC患者最差的預后(χ2＝8.201，P＝0.004，圖6)。

圖6 Kaplan-Meier分析顯示FXR低表達和miR-21高表達患者的預后最差Figure 6 Kaplan Meier analysis showed that patients with low FXR expression and high miR-21 expression had the worst prognosis

表2 NSCLC中FXR與miR-21表達的相關性分析Table 2 Correlation analysis of FXR and miR-21 expression in NSCLC

圖5 80例患者NSCLC組織中miR-21表達與配對相鄰組織的比較Figure 5 Comparison of miR-21 expression in NSCLC tissues of 80 patients with paired adjacent tissues

3 討論

NSCLC約占肺癌的85%，預后差，5年總生存率低[1]。因此，迫切需要提高NSCLC的早期診斷水平。FXR是核受體超家族的成員，在膽汁酸、膽固醇、脂質和葡萄糖代謝中起著關鍵作用[10]。最近，人們發現FXR的功能超出了新陳代謝，包括炎癥和致癌作用[11]；如Hotta等[5]發現FXR在體外和體內對包括結直腸癌在內的多種癌癥具有重要的抗癌作用；Alasmael等[4]發現FXR的激活會導致四種不同表型乳腺癌細胞系的細胞死亡:MCF-10A(正常)、MCF-7(受體陽性)、MDA-MB-231和MDA-MB-468(三重陰性)。本研究發現FXR在多個NSCLC細胞系中的表達低于16HBE正常細胞，在NSCLC組織中的表達較鄰近組織下調，并且FXR低表達與NSCLC臨床分期、腫瘤大小、T分期和淋巴結轉移(N分期)顯著相關。先前研究報道，FXR激動劑GW3965治療通過激活不同荷瘤小鼠MDSCs表面的ApoE-LRP8受體引起MDSCs凋亡，從而降低MDSCs對T細胞的抑制作用，發揮抗腫瘤作用[12]。本研究功能分析表明，利用GW3965上調NSCLC細胞中FXR的表達抑制了A549細胞的增殖和侵襲，提示FXR可能參與了NSCLC的發生發展，并可作為治療NSCLC的一種新的臨床分子標記物。

接下來，本研究試圖揭示FXR在NSCLC發生發展中的調控機制。大量研究表明，miRNA在癌癥發展中起著關鍵作用[2]。miRNA作為小的非編碼RNA，可以通過靶向mRNAs來調節基因的表達[13]。因此，miRNAs通過參與多種與癌癥相關的生物學過程，如細胞增殖和凋亡，被證明是腫瘤的癌基因和抑制因子[14]。先前在NSCLC的miRNA研究表明，miRNA具有獨特的致癌作用，如miRNA-615-3p通過抑制IGF2抑制NSCLC的腫瘤生長和轉移[15]；miR-129通過靶向SOX4抑制A549細胞的遷移和侵襲[16]。最近，FXR被報道通過與3’UTR結合來調節miR-21的表達[9]。miR-21在調節癌細胞行為和惡性腫瘤中起著重要作用，并且還可以促進肝癌細胞生長，誘導膠質母細胞瘤細胞抗凋亡特性[17]。此外，miR-21在NSCLC細胞的生長、侵襲和凋亡中起重要作用[2]。為了解釋FXR的異常表達，預測miR-21可能是FXR的候選調控因子。結果表明，miR-21在人NSCLC中過度表達，而利用GW3965激活FXR可降低miR-21，并且miR-21過表達逆轉了FXR對NSCLC細胞生長和侵襲的抑制作用。進一步通過熒光素酶報告顯示miR-21與FXR的3’UTR結合位點相結合，證實了本研究發現。以上證據表明，miR-21是一種致癌的miRNA，FXR通過靶向miR-21來抑制NSCLC細胞增殖和侵襲。本研究還發現NSCLC標本中FXR和miR-21的表達呈強負相關，并且“FXR低表達”和“miR-21高表達”共存模式預測了NSCLC患者最差的預后。基于這些研究結果，FXR激動劑GW3965在miR-21過度表達的NSCLC患者中具有潛在的臨床應用價值，以減輕miR-21的有害影響。需要進一步的臨床前和臨床研究證實這一觀點。

綜上所述，本研究揭示了FXR通過下調miR-21抑制NSCLC細胞的生長，提示調控FXR/miR-21可能是治療NSCLC的潛在策略。本研究為FXR參與NSCLC的發生發展提供了一個新的視角。