單次大劑量對比多次小劑量STZ誘導C57BL/6J小鼠糖尿病腎病模型的研究

冷昌龍皮明山龔曉康

(江漢大學武漢生物醫學研究院，武漢 430000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是以蛋白尿、水腫、高血壓和腎功能不全為主要臨床表現的糖尿病并發癥，也是引起終末期腎病，導致糖尿病患者死亡的主要病因之一[1]。DN在我國的發病率呈逐年上升趨勢，20%~30%的糖尿病患者會并發糖尿病腎病，嚴重影響了患者的生活質量[2]。目前對DN的研究雖然很多，但其具體的發病機制仍未完全闡明。因此，建立一種簡單、經濟、穩定可靠，同時病理表現與人類糖尿病腎病類似的動物模型對于深入研究DN的發病機制及新藥開發有著非常重要的意義。DN動物模型主要分為誘發型和自發型[3－4]。自發型模型大小鼠價格昂貴，對環境要求高，嚴重限制了相關研究的開展。誘發型模型常用STZ進行誘導，造模過程中STZ的注射劑量直接影響動物模型成模率及成模穩定性，但國內外STZ造模法中STZ劑量選用報道眾多，尚存有爭議[5－6]。本研究選取單次大劑量單次注射和多次小劑量連續注射STZ聯合高糖高脂飲食建立DN模型，對比觀察造模過程中模型的穩定性，旨在探索更為合理的糖尿病腎病的造模方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠(18~20)g，共48只，購于北京維通利華公司[SCXK(京)2016-0006]。飼養于江漢大學醫學院動物實驗中心[SYXK(鄂)2018-0042]，恒溫恒濕(溫度:(23±2)℃，相對濕度:60%~70%)，12 h明暗交替，動物自由進食飲水。本實驗通過江漢大學醫學院實驗動物倫理審查(IACUC20191210)，依據優化、減少、替代的3R原則進行實驗設計。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，用pH＝4.2的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在冰浴中配制，現配現用；安準血糖儀及血糖試紙(瑞士羅氏公司)；尿蛋白檢測試劑盒、血清肌酐檢測試劑盒、血清尿素氮檢測試劑盒、總膽固醇檢測試劑盒、甘油三酯檢測試劑盒、低密度脂蛋白檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；PAS染色試劑盒(上海源葉生物)；高糖高脂飼料(10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%普通飼料，江蘇美迪森生物醫藥有限公司)。小鼠代謝籠(上海玉研生物)；AU5800全自動生化分析儀(美國Beckman)；MULTISKAN GO酶標儀(美國Thermo)；EC 350-1石蠟包埋機(美國Thermo)；MICROM HM 340E石蠟切片機(美國Thermo)；BX 51顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖尿病腎病模型小鼠制備及分組

小鼠適應性喂養7 d后隨機分為3組，即普通飼料喂養組(對照組)12只，高脂高糖飼料喂養＋STZ單次大劑量組18只，高脂高糖飼料喂養＋STZ多次小劑量組18只。STZ造模組喂養高脂飼料4周后，小鼠禁食不禁水12 h，隨后對照組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液；多次小劑量組連續4 d腹腔注射STZ 50 mg/kg，單次大劑量組腹腔注射STZ 150 mg/kg一次，STZ注射2 h后給小鼠進食以防止低血糖。整個實驗期間，STZ造模組小鼠均采用高脂高糖飼料喂養。實驗期間，按照動物實驗的3R原則給予實驗動物人道主義關懷。

1.3.2 標本采集及檢測

注射STZ前及注射STZ后2、4、6、8、10周測量并記錄小鼠體重及飲水量；注射STZ前及注射STZ后2、4、6、8、10周各組小鼠禁食12 h后采取剪尾法測量空腹血糖；注射STZ后2、6、10周各組小鼠入代謝籠收集24 h尿液，采用考馬斯亮藍法測定24 h尿蛋白含量；注射STZ后第10周各組小鼠眼眶取血，2000 r/min離心取上清，用全自動生化分析儀檢測血清TC、TG、LDL、Scr及BUN，其中Scr采用苦味酸法，BUN采用脲酶法；小鼠處死后迅速剝離雙腎，生理鹽水清洗，濾紙吸干，剝離外包膜后稱雙腎重量，采用公式:腎臟指數＝m1/m2×100%(m1為小鼠雙腎總重量；m2為小鼠的體重)；將腎置于10%中性福爾馬林中固定24 h，常規脫水、石蠟包埋并切片，石蠟切片梯度脫蠟至水，蒸餾水洗2 min，過碘酸溶液氧化10 min，流水洗10 min，希夫(Schiff)試劑染色10 min，流水洗5 min，蘇木精染核2 min，流水沖洗10 min，常規脫水、透明、封片、拍照。

1.4 統計學方法

各組數據均采用平均數±標準誤(±s)表示，采用Graph Pad Prism 5.0軟件進行數據分析，組間比較采用one-way ANOVA和Duncantest檢驗方法，其中P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 狀態觀察

注射STZ后，給予小鼠充足飼料及飲水，隔天更換墊料以保持環境清潔。STZ注射72 h后，單次大劑量注射組及多次小劑量注射組小鼠均出現多飲、多食、多尿情況。STZ注射后第4周和第5周，單次大劑量組小鼠均死亡1只。到實驗結束時，單次大劑量組共死亡小鼠2只，而對照組和多次小劑量組無小鼠死亡。

2.2 小鼠體重變化

實驗期間，單次大劑量組小鼠體重緩慢增加，而多次小劑量組小鼠體重出現負增長，注射STZ 10周后多次小劑量組小鼠體重顯著低于對照組和單次大劑量組(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組小鼠建模前后體重的變化(±s)Figure 1 Change of body weight in each group before and after modeling

2.3 小鼠空腹血糖變化

注射STZ后，單次大劑量組空腹血糖迅速升高，在第4周達到峰值，且顯著高于陰對照組及多次小劑量組(P<0.001，P<0.05)，但此后呈逐漸降低的趨勢；多次小劑量組空腹血糖持續升高并保持穩定在較高水平至實驗結束，在注射STZ后的第8~10周，多次小劑量組空腹血糖顯著高于單次大劑量組(P<0.01)，見圖2。

圖2 各組小鼠建模前后空腹血糖的變化(±s)Figure 2 Change of fasting blood glucose in each group before and after modeling

2.4 小鼠飲水量變化

注射STZ后，單次大劑量組小鼠飲水量迅速增加，在第4周后達到峰值，且顯著高于對照組及多次小劑量組(P<0.001，P<0.05)，隨后有所降低，但仍顯著高于正常對照(P<0.001)。注射STZ后多次小劑量組飲水量持續升高并保持穩定至實驗結束，在第8~10周時，顯著高于單次大劑量組(P<0.01)，見圖3。

圖3 各組小鼠24 h飲水量的變化(±s)Figure 3 Change of water intake in each group

2.5 小鼠24 h尿蛋白變化

STZ注射后的第2、6周，與對照組相比，單次大劑量組和多次小劑量組的24 h尿蛋白含量顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.001)，但造模組之間差異無統計學意義(P>0.05)。第10周時，單次大劑量組24 h尿蛋白有所降低，且顯著低于多次小劑量組(P<0.001)，見圖4。

圖4 各組小鼠24 h尿蛋白的變化(±s)Figure 4 Change of 24 h urine protein in each group

2.6 各組小鼠血清TC、TG及LDL比較

STZ注射10周后，與正常對照組比較，多次小劑量組血清TC、TG及LDL水平均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.001)。相較對照組，單次大劑量組血清TC及LDL水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.001)，兩組間TG水平無顯著性差異(P>0.05)。多次小劑量組血清TG水平顯著高于單次大劑量組(P<0.001)，見表1。

表1 各組小鼠血清TC、TG及LDL水平比較(±s)Table 1 Comparion of serum TC，TG and LDL in each group

表1 各組小鼠血清TC、TG及LDL水平比較(±s)Table 1 Comparion of serum TC，TG and LDL in each group

注:與對照組相比，***P<0.001；與單次大劑量組相比，＃＃＃P<0.001。Note.Compared with the control group，***P<0.001.Compared with the single high-dose group，＃＃＃P<0.001.

組別Groups n甘油三酯(mmol/L)TG膽固醇(mmol/L)TC低密度脂蛋白(mmol/L)LDL對照組Control 12 3.54±0.08 1.12±0.06 1.25±0.04多次小劑量組Multiple low-dose 18 6.86±0.38*** 2.04±0.25***＃＃＃2.63±0.14***單次大劑量組Single high-dose 16 6.25±0.43*** 1.29±0.15 2.29±0.15***

2.7 各組小鼠血清腎功能及腎臟指數比較

STZ注射10周后，與正常對照組相比，多次小劑量組血清尿素氮、血清肌酐及腎臟指數顯著升高(P<0.001)。與正常對照組相比，單次大劑量組血清尿素氮及腎臟指數顯著升高(P<0.001，P<0.05)，血清肌酐無顯著性差異(P>0.05)。多次小劑量組血清肌酐及腎臟指數顯著高于單次大劑量組(P<0.001，P<0.01)，見表2。

表2 各組小鼠腎功能及腎臟指數比較(±s)Table 2 Comparion of kidney function and kidney index in each group

表2 各組小鼠腎功能及腎臟指數比較(±s)Table 2 Comparion of kidney function and kidney index in each group

注:與對照組相比，*P<0.05，***P<0.001；與單次大劑量組相比，＃＃P<0.01，＃＃＃P<0.001。Note.Compared with the control group， *P<0.05，***P<0.001.Compared with the single high-dose group，＃＃P<0.01，＃＃＃P<0.001.

組別Groups n血清尿素氮(mmol/L)BUN血清肌酐(mmol/L)Scr腎臟指數(%)KI對照組Control 12 21.19±0.85 19.95±3.01 1.20±0.04多次小劑量組Multiple low-dose 18 29.43±0.91*** 77.51±13.84***＃＃＃1.69±0.18***＃＃單次大劑量組Single high-dose 16 27.37±1.30*** 31.80±6.25 1.42±0.04*

2.8 各組小鼠腎病理的變化

為檢測小鼠腎中的還原糖水平，對各組小鼠的腎進行PAS染色。與對照組相比，兩種劑量組小鼠腎小球系膜細胞增生，系膜基質增多，且腎小球著色明顯增多，還原糖水平顯著高于對照組(P<0.001)。兩種劑量組比較，發現多次小劑量組還原糖的累積顯著高于單次大劑量組(P<0.001)，表明多次小劑量組腎小球損傷更為顯著，見圖5。

圖5 各組小鼠腎形態變化(PAS)Figure 5 Histological observation of kidney tissues in each group

3 討論

目前DN動物模型的建立方法主要分為自發性模型[7]和誘發性模型[8]。自發性DN模型由于其存在遺傳因素作用，糖尿病腎病的產生與臨床患者更為相似，但是相較于普通誘導鼠類模型的獲得渠道更為狹窄，價格較高，制約了其在DN研究中的廣泛使用。誘發性DN模型采用腹腔或尾靜脈注射一定劑量STZ，從而特異性損傷胰島β細胞[9]，使胰島素分泌不足，模擬糖尿病的發生，在此基礎上繼續喂養4~8周，可出現DN早期癥狀。脂代謝紊亂是DN重要危險因素之一，芝敏等[10]比較不同飲食結構建立2型糖尿病腎病大鼠模型時發現，高糖高脂可導致糖尿病腎病大鼠更為明顯的高血壓和更加嚴重的微量白蛋白尿，且易導致腎小球硬化，病理損害相對較重。C57BL/6J小鼠是有腹部肥胖和2型糖尿病基因傾向的近交系小鼠，具有ob/ob遺傳背景，對脂肪誘導血糖升高較敏感[11－12]。因此，本研究以C57BL/6J小鼠作為研究對象，首先利用高糖高脂飲食誘導出胰島素抵抗，然后注射STZ引起β細胞受損并誘發形成糖尿病模型，在此基礎上繼續喂養高脂高糖飼料，大大縮短了DN的造模時間。已有研究表明STZ的劑量與胰島的損傷程度呈明顯的正相關[13－14]，STZ劑量過大則小鼠易死亡[15]，劑量過小則成模率低[16]。本研究選擇150 mg/kg、50 mg/kg STZ分別進行單次大劑量腹腔注射及多次連續小劑量腹腔注射建立DN模型。結果顯示兩種處理方式均能使模型組小鼠出現尿量增多、飲水量增多，體重下降等糖尿病癥狀。單次大劑量組和多次小劑量組在STZ注射后的第4周空腹血糖分別為20.54 mmol/L和15.64 mmol/L，10周時血糖分別為13.75 mmol/L和18.30 mmol/L。這些結果說明單次大劑量STZ注射可使小鼠的血糖水平快速升高，但穩定性較差，隨著實驗的進行，血糖水平會有所恢復；而多次小劑量STZ注射組小鼠的血糖水平升高緩慢，但持續上升，并一直維持在較高水平。

蛋白尿的出現是腎受累的明顯特征，表明了糖尿病的并發癥—糖尿病腎病的產生[17]。實驗中，對小鼠24 h尿蛋白量進行動態監測發現，注射STZ后，單次大劑量組24 h尿蛋白持續上升至第6周后開始下降，而多次小劑量組小鼠尿蛋白持續升高，在第10周多次小劑量組24 h尿蛋白顯著高于單次大劑量組。造模10周后，多次小劑量組血清肌酐水平及腎臟指數均高于單次大劑量組，表明多次小劑量組小鼠腎功能損傷更為顯著。基質增生和間質纖維化是糖尿病腎病進展的主要病理特征[18]。腎PAS染色顯示，單次大劑量組腎小球系膜輕度增生，細胞外基質增多，改變不夠典型，而多次小劑量組組腎已出現典型病理改變:系膜區明顯擴張甚至彌漫性系膜硬化、系膜細胞增生及細胞外基質顯著增多，腎小球、腎小管基底膜增厚。根據Mogensen對DN分期標準[19]，單次大劑量組小鼠至少到達DN的Ⅱ期，多次小劑量組小鼠達DN的Ⅲ期。上述結果表明，相比于單次大劑量注射STZ，多次小劑量注射STZ對C57BL/6J小鼠造成的腎損傷更為明顯。

綜上所述，實驗結果表明單次大劑量和多次小劑量注射STZ的方法均能誘發C57BL/6J小鼠DN。單次大劑量注射與多次小劑量注射方法相比，操作簡單，用藥量小，但對小鼠的毒性較大，死亡率較高，成模率較低，血糖水平波動幅度大，有些小鼠可逐漸恢復至正常血糖水平。多次小劑量連續注射STZ聯合高糖高脂飲食，小鼠死亡率低，血糖穩定，腎病理改變典型，是理想的DN造模方法。