hACE2-KI/NIFDC小鼠主要生物學(xué)特性指標(biāo)測定

魏 杰王 洪劉甦蘇光姣娜周佳琪馮育芳秦 驍王莎莎范昌發(fā)付 瑞岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是一種在體內(nèi)有廣泛分布的鋅離子依賴蛋白酶。通過負(fù)性調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，在體內(nèi)廣泛參與心腦血管、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及腫瘤等生理和病理進(jìn)程[1－7]。

2018年本單位以C57BL/6為背景鼠，通過將人源化的ACE2基因插入小鼠ACE2基因中構(gòu)建了hACE2敲入小鼠，命名為hACE2-KI/NIFDC。該小鼠能適用于ACE2相關(guān)病理生理研究，并在2019-nCoV疾病研究、疫苗研發(fā)中發(fā)揮了重要作用[8－10]。

目前，尚沒有關(guān)于該小鼠主要生物學(xué)特性指標(biāo)的報(bào)道。本研究首次通過對不同周齡hACE2-KI/NIFDC小鼠的臟器系數(shù)、生理生化的生物學(xué)指標(biāo)的測定，為該模式小鼠提供更廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡和8周齡雌性hACE2-KI/NIFDC小鼠各10只，SPF級，體重分別為13.5~16.9 g以及18.9~21.9 g，來自本單位模式動(dòng)物室[SCXK(京)2017-0005]，飼養(yǎng)于IVC屏障環(huán)境[SYXK(京)2017-0013]，福利倫理審查由中國食品藥品檢定研究院福利倫理審查委員會審批(中檢動(dòng)(福)第(B)021號)，實(shí)驗(yàn)遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

Sartorius CPA 423電子天平(德國)；光電Mek7222血細(xì)胞分析儀(日本)；日立7080全自動(dòng)生化分析儀(日本)。

生理檢測試劑(稀釋液DH640，分析清洗液DH520、DH620，溶血?jiǎng)〥H910、DH680)購自上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司；生化檢測試劑購自中生北控生物科技股份有限公司，包含丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(底物法)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(底物法)、總蛋白試劑盒(雙縮脲法)、白蛋白試劑盒(溴甲酚綠法)、堿性磷酸酶試劑盒(NPP底物-AMP緩沖液法)、尿素氮試劑盒(尿素酶-谷氨酸脫氫酶法)、肌酐試劑盒(氧化酶法)、葡萄糖試劑盒(己糖激酶法)、鈣(鄰甲酚酞絡(luò)合酮法)、無機(jī)磷試劑盒(磷鉬酸鹽法)、總膽固醇試劑盒(CHOD-PAP法)、總膽紅素試劑盒(釩酸鹽氧化法)和甘油三酯試劑盒(GPO-PAP法)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠禁食12 h，先編號稱體重，后眼靜脈采血術(shù)取20μL抗凝血和0.5 mL全血并分離血清，分別用于生理生化指標(biāo)測定。小鼠處死后解剖臟器稱重，通過電子天平對各編號小鼠的心、肝、脾、肺、左右腎、左右腎上腺、左右卵巢進(jìn)行稱重，并計(jì)算對應(yīng)的臟器系數(shù)。22項(xiàng)血液生理指標(biāo)和13項(xiàng)血液生化指標(biāo)分別通過血細(xì)胞分析儀和生化分析儀測定。生理指標(biāo)包括:白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、血紅蛋白濃度(HGB)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCH)、血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、白細(xì)胞五分類計(jì)數(shù)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)和血小板分布寬度(PDW)。生化指標(biāo)包括:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素(BUN)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、鈣(CA)、磷(P)、總膽固醇(CHO)、總膽紅素(Tbili)和甘油三酯(TG)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

按照周齡和測定項(xiàng)目分類整理數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，并用SPSS軟件作獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析組間差異。

2 結(jié)果

2.1 臟器系數(shù)測定結(jié)果

11項(xiàng)臟器系數(shù)指標(biāo)中，8周齡組的脾、肺、胸腺、左腎、右腎占體重百分比均低于4周齡組(P<0.01)、心臟占體重百分比高于4周齡組(P<0.01)。肝、左腎上腺、右腎上腺、左卵巢、右卵巢占體重百分比兩組間無顯著性差異(表1)。

表1 4周齡和8周齡hACE2-KI/NIFDC的臟器系數(shù)比較Table 1 Organ coefficient comparison of 4-week-old and 8-week old hACE2-KI/NIFDC mice

2.2 生理指標(biāo)測定結(jié)果

4周齡在MCV、MCH、EOS指標(biāo)上高于與8周齡組(P<0.05)，在MON%指標(biāo)上低于8周齡組。其余18項(xiàng)生理指標(biāo)無顯著性差異(表2)。

表2 4周齡和8周齡hACE2-KI/NIFDC血液生理指標(biāo)的比較Table 2 Blood physiological values comparison of 4-week old and 8-week-old hACE2-KI/NIFDCmice

2.3 生化指標(biāo)測定結(jié)果

4周齡在AST、P兩項(xiàng)指標(biāo)上顯著低于8周齡組(P<0.01)，在ALP指標(biāo)上也低于8周齡組(P<0.05)。其余10項(xiàng)生化指標(biāo)無顯著性差異(表3)。

表3 4周齡和8周齡hACE2-KI/NIFDC血液生化指標(biāo)的比較Table 3 Serum biochemical values comparison of 4-week-old and 8-week-old hACE2-KI/NIFDC mice

3 討論

依據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物學(xué)數(shù)據(jù)采集技術(shù)規(guī)范》要求，測定小鼠的主要生物學(xué)特性通常選擇4周和8周齡小鼠，4周齡小鼠是免疫等常見應(yīng)用初始周齡，8周齡則代表了成年小鼠的普遍水平。這一規(guī)范同樣適用于基因工程成小鼠。

hACE2-KI/NIFDC小鼠是學(xué)界公認(rèn)的新型冠狀病毒肺炎疾病機(jī)理、藥物、疫苗的模式動(dòng)物之一[11－14]。在研究評價(jià)中，通常需要測定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臟體重量、生理生化指標(biāo)來評價(jià)疾病健康狀態(tài)以及藥物疫苗的毒副作用。因此，測定不同周齡小鼠的生物學(xué)特性指標(biāo)能夠?yàn)槠鋺?yīng)用建立基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但由于在新冠肺炎疾病研究中，該模型鼠供應(yīng)緊張，本次生物學(xué)數(shù)據(jù)僅測定了4周齡和8周齡雌性。

臟器系數(shù)是反映動(dòng)物內(nèi)臟器官狀態(tài)的生物學(xué)指標(biāo)，在毒性試驗(yàn)和安全評價(jià)中經(jīng)常通過臟器系數(shù)的變化來評價(jià)相關(guān)指標(biāo)影響因素[15－17]。本研究中，8周齡組的脾、肺、胸腺、左腎、右腎占體重百分比均低于4周齡組(P<0.01)、心臟占體重百分比高于4周齡組(P<0.01)。隨著周齡增加，脾、肺、胸腺、左腎、右腎并未出現(xiàn)與體重一致的正相關(guān)增長，反映出了不同年齡器官功能的分化成熟狀態(tài)；只有心臟的臟器系數(shù)8周齡組高于4周齡組，反映出隨著周齡增長hACE2-KI/NIFDC小鼠的心臟供血能力增強(qiáng)。

血液生理生化指標(biāo)是反映機(jī)體是否正常的兩類基礎(chǔ)指標(biāo)。本研究測定的22項(xiàng)血生理指標(biāo)和13項(xiàng)血生化指標(biāo)中，僅MCV、MCH、EOS、MON%四項(xiàng)生理指標(biāo)和AST、ALP、P三項(xiàng)生化指標(biāo)在4周齡和8周齡雌性組間存在差異，反映了離乳后和性狀表達(dá)期兩個(gè)階段在造血、免疫和肝腎功能的差異MCV、MCH是反映紅細(xì)胞體積和血紅蛋白濃度指標(biāo)，均存在4周齡高于8周齡的情況，這一結(jié)果也符合鼠成年后紅細(xì)胞體積減小以及血紅蛋白運(yùn)氧功能成熟的情況。EOS是過敏反應(yīng)指標(biāo)，4周齡高于8周齡；MON%是細(xì)胞免疫指標(biāo)，8周齡高于4周齡，這兩個(gè)指標(biāo)的變化反映出隨著周齡增長，細(xì)胞免疫不斷成熟的狀態(tài)。其中3項(xiàng)生化指標(biāo)均存在8周齡組高于4周齡組的情況。AST、ALP是評價(jià)肝功能的兩項(xiàng)指標(biāo)，P是評價(jià)腎功能的指標(biāo)。在應(yīng)用該小鼠進(jìn)行肝腎功能評價(jià)時(shí)，需要排除性別和周齡差異帶來的影響。較之常規(guī)品系，本研究中轉(zhuǎn)基因小鼠不同周齡差異化生理生化指標(biāo)相對較少，這可能也與基因敲入有關(guān)[18]。在疫苗研發(fā)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常選用4~5周的小鼠進(jìn)行免疫并定期觀察。對于雌性的該模型鼠，4周齡和8周齡組18項(xiàng)指標(biāo)和10項(xiàng)生化指標(biāo)均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但對于藥物評價(jià)通常使用某體重組的小鼠研究來說，沒有周齡界定，在評價(jià)生物學(xué)指標(biāo)時(shí)也需要關(guān)注周齡變化可能帶來的影響。