清熱潤燥口服液對哮喘小鼠ILC2s上下游細胞因子的影響

伍林澤，胡旭紅，傅榕冰，魏義杰，虎 敏，孔令麒，童曉云，吳向農，吳佳麗，聶 堅，張紹湘，虎春艷，李寶晶，魏丹霞*，黃 豐*

(1.云南中醫藥大學，昆明 650500；2.騰沖市中醫醫院，云南 騰沖 679100；3.云南中醫藥大學第一附屬醫院，昆明 650021；4.云南中醫藥大學第三附屬醫院，昆明 650011)

支氣管哮喘簡稱哮喘(asthma)，是一種臨床上常見、多發和難愈的慢性呼吸系統疾病。近年來，在基因、環境和過敏原等因素的相互作用下哮喘的發病率和死亡率逐年升高，目前全球范圍內有3~4億哮喘患者，我國成年人中哮喘患者已達到4570萬人，對人類健康構成巨大的威脅[1]。哮喘的發病機制復雜，且由多種炎性細胞和細胞因子參與，其中嗜酸性粒細胞趨化因子Eotaxin，可以激活嗜酸性粒細胞并將其募集到肺中，導致患者氣道重塑和氣道高反應性加重[2]。此外，最新研究表明先天性免疫細胞中的固有淋巴樣細胞(innate lymphoid cells，ILCs)在哮喘的發病過程中也具有重要作用[3]。來自于骨髓造血干細胞中淋巴樣前體細胞的ILCs中的Ⅱ型固有淋巴細胞(typeⅡinnate lymphoid cells，ILC2s)，在過敏性鼻炎和哮喘等疾病中的表達水平顯著升高。當肺部受到多種炎癥因素的刺激時，上皮源性細胞因子IL-33(interleukin-33)、IL-25(interleukin-25)、胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)大量分泌，并且刺激ILC2s表達2型T輔助淋巴(Th2)細胞因子IL-4(interleukin-4)和IL-5(interleukin-5)及促炎因子IL-6(interleukin-6)[4－5]，引起Th2型免疫反應，加重哮喘的氣道炎癥，從而促進哮喘的發生。

哮喘屬于中醫哮證范疇，其發病機制在中醫論述里分為夙根學說，肺虛、脾虛、腎虛學說和外邪學說等[6]。在夙根學說中宿痰伏于肺，說明肺部是哮喘發病的主要部位，痰是哮喘發病的主要病理因素。云南省榮譽名中醫陸家龍認為治療慢性氣道炎癥性疾病，要“養潤與通利”并行，并根據此觀點研制出清熱潤燥口服液。臨床證明，該方具有清肺養陰和潤肺止咳等藥效，以及安全有效的特點，用于治療慢性支氣管炎急性發作和咽炎等疾病，已在臨床上使用了30余年[7－8]。本實驗旨在通過清熱潤燥口服液對OVA致敏的哮喘小鼠的趨化因子和ILC2s數量及上下游細胞因子的影響，探討該方干預哮喘小鼠的可能作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗動物采用健康的清潔級BALB/c雌性小鼠40只，6~8周齡，體重(20±2)g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司[SCXK(遼)2015-0001]，實驗動物質量合格證號為No.211002300051473，動物飼養于云南中醫藥大學實驗動物中心[SYXK(滇)K2017-0005]，實驗經云南中醫藥大學實驗動物倫理審查委員會批準(R-06202035)，并按照實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

組成清熱潤燥口服液的桑葉、苦杏仁、浙貝母、南沙參、麥冬、蘆根、薏苡仁、陳皮、茯苓、冬瓜仁、京半夏、炒谷和炒麥芽均購于云南白藥集團，并委托云南中醫藥大學第三附屬醫院制劑室制備提供(4.1 g/mL原生藥)，藥物保存于4℃備用；地塞米松和卵清蛋白(OVA)(美國Sigma公司，批號分別為:BCBV3214、9006-59-1)；Al(OH)3粉末(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號:38701)；小鼠Eotaxin、IL-4、IL-5、IL-6、IL-33和TSLP酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(聯科生物技術有限公司，批號分 別 為:2213080441、2213080441、A20580821、A20680724、A23380314、A26580933)；小鼠IL-25(IL-17E)ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，批號:181225-007a)；倉鼠抗小鼠CD3ε抗體、大鼠抗小鼠CD4抗體、倉鼠抗小鼠CD11c抗體、大鼠抗小鼠Ly-6G和Ly-6C(Gr-1)抗體、大鼠抗小鼠CD5抗體、大鼠抗小鼠CD19抗體、小鼠抗NK1.1抗體、大鼠抗小鼠CD8α抗體(美國BD Pharmingen公司，批 號 分 別 為:553060、553728、553800、553125、553019、553784、553163、553163)；Biotin anti-mouse FceRIα(美國BioLegend公司，批號:134304)；Biotin rat anti-mouse TER119和Anti-mouse F4/80 antigen biotin(美國eBioscience公司，批號分別為:13-5921-81、13-5921-81)；Liberase TM和DNase I(瑞士Roche公司，批號分別為:35537400、35027800)；GATA3和IL-33抗體(武漢Proteintech公司，批號分別為:66400-1-Ig、12372-1-AP)；IL-5抗體(美國Signalway公司，批號為:31306-1)；KLRG1抗體(美國Fitzgerald公司，批號為:70R-18166)。超聲霧化器(德國百瑞公司，型號:INQUA NEB plus)；玻片掃描影像系統(深圳市生強科技有限公司，型號:Teksqray SQS-1000)；酶標儀(美國美谷分子，型號:Spectra Max plus384)；－80℃超低溫冰箱(美國賽默飛世爾科技公司，型號:8920)；正置光學顯微鏡、成像系統(日本尼康公司，型號分別為:Nikon Eclipse E100、NIKON DS-U3)；流式細胞檢測儀(美國BD公司，型號:LSRF ortessa)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

實驗將BALB/c小鼠(雌性)分為5組，每組8只，空白對照組(C組)、模型對照組(M組)、陽性對照組(地塞米松，DEX組)、清熱潤燥口服液低劑量組(QRRZ-L組)、清熱潤燥口服液高劑量組(QRRZH組)。

1.3.2 哮喘模型建立及給藥方法

于開始建立模型的第1、8、15天，采用腹腔注射的方式，C組每只注射生理鹽水0.2 mL，其余各組每只注射OVA混懸液(OVA和Al(OH)3配制，濃度分別為:1、5 mg/mL)0.2 mL致敏。第21天開始采用灌胃的方式給藥7 d，每天1次，C組和M組為生理鹽水(10 mL/kg)，DEX組為地塞米松溶液(1 mg/(kg·d))，QRRZ-L和QRRZ-H組分別為低(4.32 g/(kg·d))、高(8.64 g/(kg·d))劑量的清熱潤燥口服液。給藥1 h后進行霧化，除C組使用生理鹽水霧化外，其余各組使用2%OVA霧化液霧化激發1周(每天每次30 min)。

1.3.3 收集肺泡灌洗液

第28天，1%的戊巴比妥(0.01 mL/g)麻醉小鼠，隨后取血處死，開頸部暴露氣管，并進行插管，打開胸腔，用動脈夾將右支氣管夾閉，用0.3 mL PBS緩沖液抽吸灌洗右肺3遍，灌洗2次后收集。于1000 r/min，4℃離心10 min，取上清液嚴格按照試劑盒說明書操作步驟檢測BALF中Eotaxin、IL-25、IL-33、TSLP、IL-4、IL-5和IL-6的含量。

1.3.4 采集肺組織

收集完肺泡灌洗液后，取右肺中葉用PBS漂洗血液后，于濾紙上吸干殘留液體，浸泡于中性甲醛組織固定液中，浸泡36 h后將肺組織用石蠟包埋后切片，進行蘇木精-伊紅染色(HE染色)、免疫組化染色和免疫雙熒光染色；取肺上下葉置入預冷的PBS中，剪碎成小于0.5 cm×0.5 cm的碎塊后，加入Liberase TM和DNase I于37℃靜置消化1 h后研磨，制成單細胞懸液后進行流式檢測肺組織ILC2s的數目。

1.4 統計學方法

實驗數據通過SPSS 20.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析和t檢驗的方法進行多組間及組間差異比較，并以P<0.05和P<0.01表示實驗結果有顯著性差異，數據分析結果以平均數±標準差(±s)表示，并用GraphPad Prism 8軟件進行作圖。

2 結果

2.1 HE染色觀察肺組織病理改變

HE染色結果顯示:空白對照組肺組織支氣管結構清晰完整，黏膜上皮細胞完整無脫落且排列整齊，幾乎沒有炎性細胞浸潤；模型對照組較空白對照組相比支氣管壁增厚，支氣管上皮破壞不完整且氣管炎性細胞浸潤嚴重；陽性對照組和清熱潤燥口服液低高劑量組較模型對照組相比氣道周圍的炎性細胞浸潤和支氣管壁增厚特征有所減輕，如圖1所示。

圖1 清熱潤燥口服液對哮喘小鼠肺組織病理變化的影響(HE染色)Figure1 EffectofQingreRunzaooralliquidonpathological changesoflungtissueinasthmaticmice(HEstaining)

2.2 ELISA檢測BALF中Eotaxin、IL-25、IL-33、TSLP、IL-4、IL-5及IL-6的含量

2.2.1 清熱潤燥口服液對哮喘小鼠BALF中Eotaxin含量的影響

如圖2所示，模型對照組BALF中Eotaxin的含量與空白對照組相比明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)；與模型對照組相比，陽性對照組和清熱潤燥口服液高低劑量組均可使Eotaxin的含量降低，具有顯著性差異(P<0.01)。

圖2 清熱潤燥口服液對哮喘小鼠Eotaxin的影響(±s，n＝8)Figure2 EffectofQingreRunzaooralliquidon Eotaxininasthmaticmice

2.2.2 清熱潤燥口服液對哮喘小鼠BALF中IL-25、IL-33、TSLP含量的影響

如圖3所示，模型對照組BALF中IL-25、IL-33、TSLP的的含量與空白對照組相比，明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)；與模型對照組相比，陽性對照組和清熱潤燥口服液高低劑量組均可使IL-25、IL-33、TSLP的含量降低，具有顯著性差異(P<0.01)。

圖3 清熱潤燥口服液對哮喘小鼠ILC2s上游細胞因子的影響(ˉx±s，n＝8)Figure 3 Effect of Qingre Runzao oral liquid on cytokines upstream of ILC2s in asthmatic mice

2.2.3 清熱潤燥口服液對哮喘小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-6含量的影響

如圖4所示，模型對照組BALF中IL-4、IL-5和IL-6的含量與空白對照組相比明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)；與模型對照組相比，陽性對照組和清熱潤燥口服液高低劑量組均可使IL-4、IL-5和IL-6的含量降低，具有顯著性差異(P<0.01)。

圖4 清熱潤燥口服液對哮喘小鼠ILC2s下游細胞因子的影響(ˉx±s，n＝8)Figure 4 Effect of Qingre Runzao oral liquid on cytokines downstream of ILC2s in asthmatic mice

2.3 免疫組化法檢測肺組織中ILC2s上下游細胞因子IL-33及IL-5的表達

2.3.1 清熱潤燥口服液對哮喘小鼠肺組織中ILC2s上游細胞因子IL-33表達的影響

如圖5所示，模型對照組肺組織中IL-33的表達與空白對照組相比明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)；與模型對照組相比，陽性對照組和清熱潤燥口服液高低劑量組均下調肺組織中IL-33的表達，具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。

圖5 清熱潤燥口服液對哮喘小鼠肺組織中ILC2s上游細胞因子IL-33表達的影響(ˉx±s，n＝8)Figure 5 Effect of Qingre Runzao oral liquid on the expression of ILC2s upstream cytokine IL-33 in lung tissue of asthmatic mice

2.3.2 清熱潤燥口服液對哮喘小鼠肺組織中ILC2s下游細胞因子IL-5表達的影響

如圖6所示，模型對照組肺組織中IL-5的表達與空白對照組相比明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)；與模型對照組相比，陽性對照組和清熱潤燥口服液高低劑量組均下調肺組織中IL-5的表達，具有顯著性差異(P<0.01)。

2.4 流式細胞術檢測肺組織中ILC2s的數量變化

運用流式細胞術檢測清熱潤燥口服液的高劑量對哮喘小鼠肺組織中ILC2s數量的影響。如圖7所示，模型對照組肺組織中ILC2s數量與空白對照組相比明顯增高，具有顯著性差異(P<0.01)；與模型對照組相比，陽性對照組和清熱潤燥口服液高劑量組可使肺組織中ILC2s數量降低，具有顯著性差異(P<0.01)。

圖7 清熱潤燥口服液對哮喘小鼠肺組織中ILC2s數量的影響(ˉx±s，n＝5)Figure 7 Effect of Qingre Runzao oral liquid on the amount of ILC2s in the lung tissue of asthmatic mice

2.5 免疫雙熒光染色檢測肺組織中ILC2s的生成

免疫雙熒光染色法檢測GATA3(紅)與KLRG1(綠)的表達，確定ILC2s的生成。如圖8所示，模型對照組肺組織中ILC2s與空白對照組相比明顯增多；與模型對照組相比，陽性對照組和清熱潤燥口服液高低劑量組均可降低肺組織中ILC2s的生成。

圖8 清熱潤燥口服液對哮喘小鼠肺組織中ILC2s生成的影響Figure 8 Effect of Qingre Runzao oral liquid on ILC2s production in lung tissue of asthmatic mice

3 討論

清熱潤燥口服液經過現代工藝加工和臨床療效研究而成，是由桑葉、苦杏仁、陳皮、浙貝母、南沙參、麥冬、蘆根、薏苡仁和茯苓等中藥組成的復方制劑，其中桑葉歸肺、肝經，清肺潤燥；苦杏仁歸肺經，化痰、止咳和平喘；陳皮歸肺、脾經，理氣化痰等，方中諸藥配伍，共同發揮其藥效。在動物實驗的研究中表明其具有抗炎、祛痰、止咳和平喘的作用[7－9]，利用高效液相色譜法和紫外分光光度法測定該方的橙皮苷、苦杏仁苷和總多糖的含量[10－12]，對本制劑進行有效的質量控制。本實驗使用清熱潤燥口服液治療OVA致敏的哮喘小鼠，探索其可能的作用機制，為哮喘疾病的中醫藥研究提供參考。

支氣管哮喘是以氣道高反應性、可逆性的氣道阻塞和重塑、黏液高分泌和肺功能下降為主要特征的一種肺部炎癥，由嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、肥大細胞和上皮細胞參與[13]。哮喘的發病機制尚未完全闡明，其中CD4＋Thelper(Th)細胞的Th1/Th2細胞比例失衡，導致Th2細胞優勢應答，產生IL-4、IL-5等炎性因子，引起Th2型免疫反應，是哮喘重要的發病機制[14]。哮喘Th2型免疫反應的主要特征之一是嗜酸性粒細胞增多、遷移和黏液增生[13]，還會產生趨化因子和多種細胞因子，其中趨化因子Eotaxin分子量為8×103~10×103，由73個氨基酸組成，屬于CC趨化因子亞家族，是嗜酸性粒細胞的特異性趨化因子，對嗜酸性粒細胞有強大的選擇性激活作用。與趨化因子受體CCR3結合后，發揮活化和募集嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的功能，引起哮喘患者的支氣管粘膜和肺泡周圍的炎性細胞浸潤，導致支氣管上皮損傷。還能誘導白三烯、組胺的生成和肥大細胞的遷移分化，參與哮喘的炎癥過程[15]。實驗中對各組小鼠肺切片進行HE染色，結果顯示(圖1)，模型對照組小鼠的支氣管上皮粘膜破損不完整、支氣管壁增厚及大量的炎性細胞浸潤，而清熱潤燥口服液能減輕上述病理特征。

研究表明，先天性淋巴樣細胞ILCs(根據分泌的細胞因子不同，分為三類:ILC1s、ILC2s和ILC3s)中的ILC2s與哮喘密切相關。在反式T細胞特異性轉錄因子(GATA-3)及維甲酸受體相關的孤兒受體α(RORα)的共同調控下產生，分布在肺、血液、脾和骨髓中，并在哮喘患者的外周血和痰液中高表達，可以產生TH2型細胞因子和其他細胞因子，是Th2型免疫反應的主要驅動因素，參與過敏性哮喘和特應性皮炎等疾病過程，調節炎癥過程和參與組織修復，在哮喘的發病過程中具有重要作用[16－18]。

ILC2s的表面表達IL-17RB、ST2(也稱T1/ST2L)和TSLPR受體，當支氣管或肺部受到過敏、病毒、寄生蟲和炎癥因子的刺激時，分泌IL-25、IL-33和TSLP細胞因子并與ILC2s表面受體結合，產生Th2型細胞因子[16]。IL-1細胞因子家族的IL-33可直接激活ILC2s，是過敏性氣道疾病的關鍵細胞因子，可驅動Th2免疫應答[19]。袁琳潔等[20]利用IL-33滴鼻誘導小鼠哮喘模型，并出現氣道高反應性、炎性細胞浸潤和肺組織中ILC2s細胞數量增多的現象。IL-33還可通過p38 MAPK信號通路刺激腸系膜脂肪中分離的ILC2s細胞產生IL-5、IL-9等細胞因子，是ILC2s產生細胞因子最重要的激活劑之一[21]。IL-17細胞因子家族的IL-25(也稱IL-17E)在哮喘患者的支氣管和外周血中較正常人明顯升高，臨床研究發現，在哮喘患者支氣管中隨著IL-25的表達量升高，患者的嗜酸性粒細胞氣道炎癥和氣道高反應性加重[22]。IL-25可刺激Th2型細胞因子的表達，還能經鼻腔激發健康小鼠的氣道高反應性和氣道重塑、杯狀細胞和粘膜增生、加重肺支氣管和血管周圍的嗜酸性粒細胞浸潤[23]。IL-2細胞因子家族的TSLP與IL-25和IL-33共同刺激Th2型細胞因子的產生，參與過敏性哮喘的發病過程和對過敏因子的免疫反應[24]。在TSLPR－/－基因缺陷小鼠誘導的哮喘小鼠中，肺中ILC2s的活化和先天性過敏氣道炎癥反應受到抑制。TSLP和IL-33在體內和體外刺激肺部ILC2s產生彼此的受體，對刺激肺部ILC2s的產生具有協同作用[25]。

在ILC2s的激活下產生IL-4和IL-5等Th2型細胞因子和具有強大促炎作用的IL-6，IL-6是CD4＋T細胞分化的重要調節因子，能促進IL-4產生和抑制Th1分化，并在哮喘患者血清中高表達[26]。IL-4和IL-5在支氣管粘膜中高表達，其中IL-5可誘導嗜酸性粒細胞的分化與激活，并將其募集到肺中，在募集過程中與Eotaxin具有協同作用，然后分泌大量的炎癥細胞因子和趨化因子等促炎介質，在嗜酸性炎癥中起重要作用[27]。用人源化抗IL-5抗體治療嗜酸性哮喘患者后，可減少患者血液和痰中的嗜酸性粒細胞表達水平[28]。IL-4可刺激Th2細胞的分化，與IL-13一同促進B淋巴細胞向免疫球蛋白-e(IgE)轉變，引起肥大細胞和嗜堿性細胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯、細胞因子和趨化因子等多種炎性介質，促進炎癥和過敏疾病的發生[13，29]。本實驗通過檢測BALF中ILC2s相關的細胞因子，發現清熱潤燥口服液高低劑量可降低趨化因子Eotaxin和促炎因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-25、IL-33和TSLP在BALF中的含量(P<0.01)。通過免疫組化染色、流式細胞術和免疫雙熒光染色結果，發現清熱潤燥口服液高低劑量可下調肺組織中IL-33及IL-5的表達(P<0.05，P<0.01)，減少哮喘小鼠肺組織中ILC2s的數量及生成(P<0.01)。提示該方對OVA致敏的哮喘小鼠的ILC2s數量和其相關細胞因子及IL-33和IL-5蛋白的表達有一定的調節作用。

綜上所述，清熱潤燥口服液可能通過調節ILC2s細胞數量，及BALF中相關細胞因子的含量(趨化因子Eotaxin；上游細胞因子:IL-25、IL-33、TSLP；下游細胞因子:IL-4、IL-5、IL-6)和肺組織中IL-33和IL-5的表達來干預哮喘；提示該藥可能通過降低ILC2s的數量及其相關的細胞因子含量和肺組織中IL-33和IL-5的表達來緩解哮喘小鼠的癥狀，但清熱潤燥口服液具體通過ILC2s細胞方面對哮喘疾病的影響有待進一步的研究。