血清LTD4在非酒精性脂肪性肝病診斷中的臨床意義*

孫立平，朱繼寶，孫立珍

(首都醫科大學密云教學醫院:1.感染性疾病科;2.檢驗科，北京 101500)

目前，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在全世界的發生率逐漸升高，影響了全世界約1/4的人群[1]，嚴重危害了公眾健康。NAFLD包括一系列肝臟疾病，從非酒精性脂肪肝(NAFL)到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，最終可能導致肝硬化和肝細胞癌[2]。從2015年到2030年，美國NAFLD患者預計將增加21%，從8 310萬例(2015年)增加到1.009億例(2030年)，NASH患者數將從1 652萬例增加到2 700萬例[3]。NASH是由脂肪積累而造成肝細胞損傷，同時伴有肝臟炎癥形成的疾病,其典型特征是肝臟組織學上的改變，包括脂肪變性、小葉炎癥、伴或不伴竇周纖維化的氣球樣變[1]。細胞膜磷脂發生病理、生理改變時可出現花生四烯酸(AA)的氧化物；AA經脂氧合酶(LOX)代謝途徑后產生的物質包括白三烯(LT)；LTD4作為炎性趨化因子中作用最強的半胱氨酰LT分子，是由AA經5-LOX途徑代謝生成的一類重要炎癥介質[4]。研究已經證實，LTD4在原發性肝癌中會過度表達[4]，同時作為重要的炎癥介質，參與了多種炎性反應過程。當NAFLD患者肝臟發生炎性反應時，是否也有LTD4的表達呢？目前有關檢測NAFLD患者體內LTD4的報道較少見。本研究分析了NAFLD患者血清LTD4水平變化情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年9月至2020年6月本院肝病門診NAFLD患者46例作為研究對象，根據疾病類型將其分為NASH組(25例)和NAFL組(21例)。同時選取15例健康志愿者作為對照組。診斷標準：符合《非酒精性脂肪肝性肝病診療指南(2010年修訂版)》診斷標準。排除標準：各種肝炎、自身免疫性疾病、糖尿病等可能影響LTD4水平的疾病。3組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組一般資料比較

1.2方法 于清晨空腹狀態下抽取靜脈血5 mL至未加抗凝劑的紅頭管內，經離心后，留取血清1 mL，并置于-80 ℃冰箱保存。將標本送至本院檢驗科檢測谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)。血清LTD4采用酶聯免疫吸附試驗雙抗體夾心法檢測，檢測試劑盒由上海研謹生物科技有限公司提供，嚴格遵照試劑盒操作說明書進行。(1)設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度標準品50 μL；(2)樣本孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，空白孔不加；(3)除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min；(4)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次；(5)每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；(6)每孔加入終止液50 μL，15 min內在450 nm波長處測定各孔的吸光度值。

2 結 果

2.13組ALT、AST水平比較 3組ALT、AST水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。NASH組ALT、AST水平均高于NAFL組和對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 3組ALT、AST水平比較

2.23組血清LTD4水平比較 NASH組血清LTD4水平為(676.86±74.01)ng/mL，明顯高于NAFL組和對照組的(462.20±54.51)、(475.11±38.51)ng/mL，差異有統計學意義(P<0.05)。NAFL組血清LTD4水平與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3血清LTD4診斷效能分析 血清LTD4診斷NASH的曲線下面積為0.996(95%CI為0.987～1.000，P<0.001)。見圖1。

圖1 ROC曲線

2.4LTD4水平與ALT、AST水平相關性分析 在NASH患者中，LTD4水平與ALT、AST水平無相關性(r=0.115、0.090，P>0.05)。

3 討 論

目前，全球NAFLD發生率可達25%，其中59%會進展為NASH[5]，而且NAFLD可直接導致失代償期肝硬化和肝細胞癌，嚴重危害人類健康[6]。NASH患者發生肝硬化的概率是單純性脂肪變的11倍[7]。研究表明，與健康人群相比，NAFLD患者平均壽命縮短4～10年，主要與NAFLD所導致的惡性腫瘤、心腦血管事件發生風險升高有關[8]。近年來對于NAFLD的發病機制還未完全闡明，越來越多的NASH相關肝損害研究指出，細胞因子和炎性因子介導肝臟的慢性炎性反應[9]。LTD4是花生四烯酸在白細胞中代謝后的產物，不僅直接參與了炎癥過程的調控，而且還具有調控細胞增殖、分化等功能[10]。

NASH是NAFLD的活動形式，是發生慢性肝病并發癥的最大風險。ALT與AST分別存在于肝細胞和肝細胞的線粒體中。循環血液中ALT與AST的水平升高說明肝細胞發生炎性壞死，肝細胞內的ALT、AST溢出細胞外進入血液循環，導致了外周血液中ALT、AST水平升高。本研究結果顯示，NASH組ALT、AST水平明顯高于NAFL組和對照組。提示NASH患者具有肝細胞損傷。有研究發現，免疫相關炎癥的變化在NAFLD的發病機制中起著非常重要的作用[11]。NASH患者肝細胞發生了炎性反應，會產生很多重要的炎癥介質，而LTD4就是其中之一。本研究結果顯示，3組血清LTD4水平比較，NASH組最高，且NAFL組和對照組血清LTD4水平無明顯差異。提示NASH患者體內LTD4呈高水平表達狀態，其參與了NASH患者肝臟的炎性反應。LTD4是某些變態反應及炎癥疾病中的化學介質，在機體出現炎性反應時，LTD4水平會顯著提高[12]。肝臟的炎性反應主要是由浸潤的炎性細胞，如單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等，以及大量促炎性細胞因子和趨化因子共同作用的結果。LT由LTB4和半胱氨酰(包括LTC4、LTD4和LTE4)組成。肝臟的Kupffer細胞、肥大細胞和內皮細胞也可以產生LT，而且在肝內LTC4經過LTD4代謝為LTE4，而肝實質細胞是否合成LT目前尚不清楚。LTD4作為重要的炎癥介質，一方面可能引發肝細胞損傷，促進癌變；另一方面，在炎癥的加劇方面扮演了重要的角色。

本研究結果顯示，血清LTD4診斷NASH的曲線下面積為0.996。提示LTD4在NASH的診斷中具有重要意義。此外，本研究結果還顯示，LTD4水平與ALT、AST水平無相關性，這與張繼舜等[12]研究結果不一致，與ZHOU等[13]研究一致。體外實驗發現，LTD4在細菌內毒素及病毒的協同作用下可導致肝細胞損害[14]。而NAFLD與原發性肝癌沒有這些誘因。同時，有研究發現，單純LTD4僅對肝細胞造成輕度損傷，但其又可顯著促進D-氨基半乳糖的肝細胞毒性作用，從而誘發急性肝損害[14]。因此，在NASH患者血清中，LTD4水平升高的原因可能為肝細胞內的脂質經氧化應激后導致肝細胞損傷，繼而發生的炎性反應導致了LTD4水平升高，同時高水平LTD4又可導致肝細胞損傷[12-13]。LTD4對肝細胞的損傷程度不一，因此NASH患者LTD4水平的高低與患者肝功能水平沒有明顯關系，其在血清中的表達量不能判斷肝細胞損傷情況。LTD4是否對病情的發展及預后尤其是對肝癌的進展有意義仍需進一步研究。

綜上所述，NAFLD患者肝臟發生炎性反應時，即NAFLD進展為NASH時，患者體內LTD4水平會顯著升高，這對NASH的診斷及評估具有重要意義。但是LTD4與肝硬化和肝癌的進展是否有關系，還需要大量的臨床樣本和分子生物學的實驗來進一步證實。