白及顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

楊深應(yīng)，陶明寶，董全玉，沈紅春，楊勝芳，李 杉，趙興蕊△

（1.云南省保山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，云南 保山 678000；2.云南省保山市隆陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心，云南 保山 678000；3.保山中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，云南 保山 678000）

白及顆粒由白及單味藥材經(jīng)加工制成，具有收斂、止血、補(bǔ)肺功效，臨床用于治療肺結(jié)核、慢性氣管炎、百日咳、肺氣腫，久咳傷肺、咯血吐血［1］。白及藥材為蘭科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.的干燥塊莖［2］。因其種子繁育困難，野生資源急劇減少，不能滿足市場需求，價(jià)格居高不下，導(dǎo)致市場上白及藥材摻偽現(xiàn)象突出［3］。目前白及偽品主要有獨(dú)蒜蘭、云南獨(dú)蒜蘭、黃花白及、水白及、滇黃精、毛梗蘭、杜鵑蘭、紫花美冠蘭、小白及、山慈菇、筒瓣蘭等［4］，白及顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十二冊）》，僅有理化鑒別，無定性、定量檢測項(xiàng)目［1］。參考文獻(xiàn)［2－20］，本研究中建立了定性鑒別白及顆粒中白及藥材的薄層色譜（TLC）法，以及測定白及藥材中指標(biāo)性成分1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯含量的高效液相色譜（HPLC）法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），包括G13l1C型四元泵帶真空脫氣機(jī)、G1329B型自動進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G1315D型二極管陣列檢測器、Agilent Chemstation型儀器控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；SartoriusBP211D型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01 mg/0.1mg）；BPG－9140A型精密鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；A2S－10－BE型超純水機(jī)（美國艾科浦國際有限公司）；SK2510LHC型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為35/53 kHz）。

1.2 試藥

白及對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號為110770－201918）；1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯對照品（成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號為DST190724－025，純度為98.61%）；白及顆粒（企業(yè)A，云南玉藥生物制藥有限公司，批號分別為20200103，20200403，20200412，20180702；企業(yè)B，云南裕豐藥業(yè)有限公司，批號分別為2006003，1912005 092，2004006，2004008；企業(yè)C，云南萬裕藥業(yè)有限公司，批號分別為1904002 097，1906004 081），規(guī)格均為每袋10 g；乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇、乙醇、磷酸、三氯甲烷等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

分別取10批樣品，各5 g，研細(xì)，置錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲（功率為250 W，頻率為35 kHz）處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得供試品溶液。取蔗糖適量，同法制備缺白及的陰性對照藥材溶液。取白及對照藥材1 g，同法制備白及對照藥材溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法［8］試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、陰性對照藥材溶液各20μL，白及對照藥材溶液10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（12∶1∶0.1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴2%香草醛硫酸溶液顯色，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

1－10.供試品溶液（批號分別為20200103，20200403，20200412，20180702，2006003，1912005 092，2004006，2004008，1904002 097，1906004 081）11.白及對照藥材溶液 12.陰性對照藥材溶液圖1 薄層色譜圖1－10.Test solution（batch numbers：20200103，20200403，20200412，20180702，2006003，1912005 092，2004006，2004008，1904002 097，1906004 081）11.Reference material solution of Bletillae Rhizoma 12.Negative reference medicinal material solutionFig.1 TLC chromatogram

2.2 1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈－0.1%磷酸溶液（22∶78，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：223 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯峰計(jì)應(yīng)大于3 000。

1.1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯A.對照品溶液 B.供試品溶液C.陰性對照品溶液圖2 高效液相色譜圖1.militarineA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

2.2.2 溶液制備

取1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯對照品28.18 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解，定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為555.77μg/mL的對照品貯備液。取貯備液3 mL，置20 mL容量瓶中，加稀乙醇稀釋成每1 mL含83.37μg的對照品溶液。取樣品適量，研細(xì)，取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為250 W，頻率為35 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按處方比例及工藝制備缺白及的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺白及的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2.2.2項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯色譜峰分離良好，且陰性對照無干擾。詳見圖2。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下對照品溶液（質(zhì)量濃度為83.37μg/mL）1，5，10，15，20，25，30μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝1 585.367 31X－1.183 73，r＝0.999 9（n＝7）。結(jié)果表明，1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯進(jìn)樣量在0.083 4～2.501 1μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2.2項(xiàng)下對照品溶液（質(zhì)量濃度為83.37μg/mL）10μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯峰面積的RSD為0.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為20200103）1.0 g，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯含量的平均值為2.158 8 mg/g，RSD為0.43%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號為20200103），依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，12，18，24 h時(shí)進(jìn)樣測定峰面積。結(jié)果1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯峰面積的RSD為1.02%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量為2.158 8 mg/g的樣品（批號為20200103）0.5 g，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，分別精密加入質(zhì)量濃度為222.31μg/mL的對照品溶液5 mL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

分別取10批樣品，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定3次，記錄峰面積，并計(jì)算樣品中1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab.2 Results of content determination of militarine in the samples（n＝3）

3 討論

3.1 TLC鑒別方法選擇

考察了供試品溶液、對照藥材溶液的制備方法，白及顆粒按2020年版《中國藥典（一部）》白及藥材項(xiàng)下TLC法制備供試品溶液及對照藥材溶液［2］，結(jié)果供試品溶液色譜斑點(diǎn)比對照藥材溶液色譜斑點(diǎn)少。考察了甲醇超聲處理后蒸干溶解直接點(diǎn)樣的方法，結(jié)果供試品溶液的色譜斑點(diǎn)與對照藥材溶液的色譜斑點(diǎn)基本一致［6］。考察了環(huán)己烷－乙酸乙酯－甲醇（6∶2.5∶1，V/V/V）溶液，石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1，V/V/V）上層溶液，三氯甲烷－甲醇－水（12∶1∶0.1，V/V/V）溶液等不同展開系統(tǒng)的展開效果，以及10%硫酸乙醇溶液、1%香草醛－10%硫酸乙醇溶液、2%香草醛硫酸溶液的顯色效果，結(jié)果以三氯甲烷－甲醇－水（12∶1∶0.1，V/V/V）溶液為展開劑時(shí)斑點(diǎn)的分離度較好，以2%香草醛硫酸溶液為顯色劑時(shí)的顯色較清晰。

3.2 檢測波長選擇

取1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯對照品溶液，采用紫外分光光度計(jì)于190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯在223 nm波長處有最大吸收，故選擇223 nm作為檢測波長。

3.3 提取條件選擇

考察了不同溶劑（乙醇、甲醇、70%甲醇、稀乙醇）的提取效果，結(jié)果提取溶劑為稀乙醇時(shí)待測成分的提取率最高。考察了不同超聲時(shí)間（20，30，45，60 min）的提取效果，結(jié)果超聲30 min已提取完全。故提取條件為稀乙醇超聲提取30 min。

3.4 樣品分析

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯具有益智、延緩衰老、防治老年癡呆的功效，是白及藥材的指標(biāo)性成分，且含量較高［11－17］，故選擇其作為白及顆粒含量測定的控制指標(biāo)。本研究中建立了定性鑒別白及顆粒中白及藥材的TLC法和1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯［8］的含量測定方法，并對10批同一廠家不同批號和不同廠家的白及顆粒進(jìn)行了比較。結(jié)果TLC鑒別中10批樣品的色譜斑點(diǎn)與白及對照藥材色譜斑點(diǎn)基本一致，但同一廠家不同批號及不同廠家的白及顆粒中，1，4－二［4－（葡萄糖氧）芐基］－2－異丁基蘋果酸酯含量差異較大，表明目前市場上流通的白及顆粒質(zhì)量參差不齊，需進(jìn)一步完善白及顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本研究中建立的方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好，可用于白及顆粒的質(zhì)量控制。