香菊片質量控制研究

李 春，賈文江，李 宏，劉 崢

（陜西省商洛市藥品檢驗所，陜西 商洛 726000）

香菊片由化香樹果序（除去種子）、夏枯草、野菊花、黃芪、辛夷、防風、白芷、甘草、川芎9味中藥提取制成，功能辛散祛風、清熱通竅，用于治療急、慢性鼻竇炎和慢性鼻炎。目前香菊片已收錄的標準只有黃芪中主要成分黃芪甲苷的含量測定，但不能全面、準確地評價產品質量［1］。中藥指紋圖譜運用現代分析技術以圖形的形式表達中藥化學信息，具有整體性和模糊性的特點，全面呈現了中藥各成分間的相互作用，高效、準確、全面［2］。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測定香菊片中沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸銨9種主要功效成分的含量，并建立了香菊片指紋圖譜共有模式，對其共有峰進行指認和歸屬確定?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 InfinityⅡ型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Sartorius SQP型電子天平（賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司，精度為0.1 mg）；KQ－250DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；RS30UVE型實驗室超純水機（上海和泰儀器有限公司）。

1.2 試藥

沒食子酸對照品（批號為110831－201605，含量以90.8%計），咖啡酸對照品（批號為110885－201703，含量以99.7%計），綠原酸對照品（批號為110753－201817，含量以96.8%計），升麻素苷對照品（批號為111523－201712，含量以97.4%計），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號為111920－201606，含量以97.6%計），5－O－甲基維斯阿米醇苷對照品（批號為111523－201811，含量以97.4%計），迷迭香酸對照品（批號為111871－201706，含量以90.5%計），蒙花苷對照品（批號為111528－201710，含量以96.6%計），甘草酸銨對照品（批號為111731－201720，含量以97.7%計），辛夷對照藥材（批號為121079－201205），防風對照藥材（批號為120947－201810），夏枯草對照藥材（批號為120993－201306），黃芪對照藥材（批號為121462－201705），均購于中國食品藥品檢定研究院；化香樹果序對照藥材（廣元市黎生中藥材專業合作社，批號為Z190801），香菊片（批號分別為181003，191110，191201，191203，191204，191208，191209，規格為每片0.32 g），均購自陜西香菊藥業集團有限公司；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲醇、磷酸（分析純，成都市科隆化學品有限公司）；超純水（實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［3－7］

色譜柱：Kromasill00－5－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）－0.5%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：40℃；進樣量：5μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase

2.2 溶液制備

取沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸銨對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制成質量濃度分別為23.154 0，16.262 4，11.964 0，11.882 8，16.396 8，11.103 6，19.005 0，27.434 0，23.448 0μg/mL的混合對照品溶液。取7批樣品，各20片，除去包衣，研細，取粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）45 min，取出，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。取對照藥材化香樹果序、辛夷、防風、夏枯草、黃芪，按制備工藝煎煮2次，合并煎液，濃縮至干，加60%乙醇30 mL，過濾，低溫蒸干，用甲醇5 mL溶解，濾過，取續濾液作為對照藥材溶液。取除化香樹果序（除去種子）、辛夷、防風、夏枯草、黃芪及其他藥材，按香菊片處方工藝制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照藥材溶液。

2.3 指紋圖譜建立及分析

2.3.1 方法學考察

精密度試驗：取同一批（批號為191208）樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定6次，記錄色譜圖。結果以迷迭香酸色譜峰為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.73%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于1.51%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為191208）樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣測定，記錄色譜圖。結果以迷迭香酸色譜峰為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.51%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于1.44%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為191208）樣品，依法制備供試品溶液，共6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果以迷迭香酸色譜峰為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.82%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于1.52%（n＝6），表明方法重復性好。

2.3.2 指紋圖譜建立及相似度評價

取6批樣品（編號為S1－S6），按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。詳見圖1。將6份指紋圖譜依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012A版）軟件，采用中位數法，設定時間窗口為0.1，經多點校正，生成指紋圖譜共有模式，共得到18個共有峰。詳見圖2。以6批樣品生成的指紋圖譜共有模式為對照圖譜，計算各譜圖與共有模式的相似度。結果6批指紋圖譜的相似度分別為0.965，0.973，0.976，0.964，0.969，0.977。

圖1 樣品高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprints of the sample

圖2 高效液相色譜指紋圖譜共有模式Fig.2 The common pattern of HPLC fingerprints

2.3.3 共有峰指認與歸屬

取2.2項下混合對照品溶液和對照藥材溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，并與指紋圖譜共有模式中各主要共有峰進行對比。以保留時間為評價指標，指認出指紋圖譜共有模式中3，4，5，7，8，10，11，13，14號特征峰分別為沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸銨；與同樣條件下測得的對照藥材的指紋圖譜進行比較，確認1，2，3號峰來源于化香樹果序，5，11號峰來源于夏枯草，7，9，10號峰來源于防風，8號峰來源于黃芪，4，6，12，15，16，17，18號峰來源于辛夷。詳見圖3。

圖3 指紋圖譜疊加圖Fig.3 Superimposed fingerprints

2.4 含量測定

2.4.1 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下3種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（見圖4）。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰出現，理論板數按迷迭香酸峰（11號峰）計均大于3 000。

線性關系考察及檢測限（LOD）和定量限（LOQ）確定：精密吸取沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸銨質量濃度分別為154.360 0，65.050 0，11.964 0，11.882 8，81.984 0，11.103 6，19.005 0，27.434 0，234.480 0μg/mL的混合對照品溶液1，2，5，10，15，20 mL，分別置20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以各組分對照品質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。取2.2項下混合對照品溶液，用甲醇逐步稀釋，按各組分色譜峰信噪比（S/N）分別為3∶1和10∶1時測定LOD和LOQ。結果見表2。

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果見表2，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為191208）樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣測定，記錄峰面積。結果見表2，表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為191208）樣品，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果見表2，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為191208）1 g，精密稱定，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別精密加入沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸銨對照品適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算各成分平均加樣回收率。結果見表2。

表2 香菊片中9種成分含量測定方法學考察結果（n＝6）Tab.2 Results of the methodological investigations of the content determination of the content determination of nine components in Xiangju Tablets（n＝6）

1.沒食子酸 2.綠原酸 3.咖啡酸 4.升麻素苷 5.毛蕊異黃酮葡萄糖苷 6.5－O－甲基維斯阿米醇苷 7.迷迭香酸 8.蒙花苷 9.甘草酸銨A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照藥材溶液圖4 高效液相色譜圖1.gallic acid 2.chlorogenic acid 3.caffeic acid 4.prim－O－glucosylcimifugin 5.calycosin－7－O－glucoside 6.5－O－methylvisammioside 7.rosmarinic acid 8.buddleoside 9.ammonium glycyrrhetateA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference medicinal materials solutionFig.4 HPLC chromatograms

2.4.2 樣品含量測定

取7批香菊片樣品各適量，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定3次，記錄色譜圖，按外標法分別計算各成分的含量。結果見表3。

表3 香菊片中9種成分含量測定結果（mg/g，n＝3）Tab.3 Determination results of nine components in Xiangju Tablets（mg/g，n＝3）

3 討論

考察了不同提取方法（超聲提取和加熱回流提?。?，不同提取時間（30，45，60 min），不同流速（0.6，0.8，1.0 mL/min），不同柱溫（25，30，35，40℃），不同進樣量（5，10，20μL），不同流動相體系（甲醇、乙腈、不同比例磷酸水溶液），不同檢測波長（190～400 nm）對含量測定結果的影響。綜合色譜峰基線平穩，保留時間適中，峰形及峰分離情況，最終選擇2.1項下色譜條件。

本研究中測定了6批香菊片的指紋圖譜，并采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012A版）建立了指紋圖譜的共有模式，相似度比較結果顯示，不同批次香菊片的差異較小，表明其質量較穩定。采用中位數法，經多點校正，自動匹配生成了18個共有峰，指認其中的9個指標成分，分別為沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸銨。現代藥理學研究表明，上述9種成分主要具有抗炎、抗過敏的藥理學作用，與香菊片的藥效相關，能較好地反映產品質量［8－11］。

綜上所述，建立的方法操作簡便，結果準確，重復性和穩定性均較好，可用于香菊片的質量控制，可為其選料、生產、儲存、檢驗等過程的質量控制提供參考。