響應面法優化夏枯草中總黃酮提取工藝及其抗氧化活性分析

李 鑫，赫 捷，趙 琳，薛 陽，周文君，劉 佳

（1.遼寧省朝陽市檢驗檢測認證中心，遼寧 朝陽 122000；2.遼寧省朝陽市第二醫院，遼寧 朝陽 122000；3.遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600）

夏枯草Prunella vulgarisL.為唇形科植物，性寒，味辛、苦，具有清泄肝火、散結消腫、清熱解毒、祛痰止咳、涼血止血功效，用于治療淋巴結核、甲狀腺腫、乳癰、急性傳染性黃疸型肝炎、細菌性痢疾等癥［1］。現代藥理學研究表明，夏枯草有較好的降血壓作用［2］，主要成分為黃酮類物質［3］。黃酮類化合物對心血管系統有明顯的藥理作用，具有抗氧化、降血壓、擴張血管、降低血管通透性、減少脆性、降低肝脂肪等作用［4］。基于中藥質量標志物（Q－Marker）的概念［5］，所測成分的藥效應與該藥的藥理作用一致。本研究中擬對夏枯草中總黃酮提取工藝及抗氧化活性進行研究［6－9］。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV2550型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；CPA225D型電子天平（精度為十萬分之一），BSA224S－CW型電子天平（精度為萬分之一），均購于賽多利斯科學儀器有限公司；9860A型超聲波清洗器（天津市科貝爾光電技術有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

夏枯草藥材購于安徽亳州飲片市場，經遼寧省朝陽市檢驗檢測認證中心張秀麗主任中藥師鑒定為唇形科植物夏枯草的干燥果穗。蘆丁標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100080－20181，純度為92.2%），1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH，批號為20180615），2，2′－聯氮－雙（3－乙基－苯并噻唑啉－6－磺酸）二銨鹽（ABTS，批號為20180304），均購自北京索萊寶科技有限公司；乙醇（色譜純，批號為20190117），維生素C（批 號 為20191202），硝 酸 鋁（分 析 純，批 號 為20161221），過硫酸鉀（分析純，批號為20160917），均購于國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸鈉（批號為20170427），氫氧化鈉（批號為20170329），均為分析純，購于天津市科密歐化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 夏枯草總黃酮含量測定（紫外分光光度法）

對照品溶液制備：取蘆丁標準品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加50%乙醇溶液60 mL，超聲溶解，加50%乙醇稀釋至刻度，混勻，即得質量濃度為0.23 mg/mL的對照品溶液。

標準曲線確定：取蘆丁對照品溶液0，1，2，4，6，8，10，15 mL，分別置25 mL容量瓶中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置10 min；再加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻，靜置10 min；加入5 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻，靜置10 min，用50%乙醇溶液稀釋至刻度。以空白試劑作為空白對照，于510 nm波長處測定吸光度值，記錄各蘆丁含量和吸光度，計算回歸方程，得Y＝0.2066X＋0.004 8（r＝0.999 6，n＝8）。結果表明，蘆丁含量在0.23～3.45 mg范圍內與吸光度線性關系良好。

總黃酮提取量測定：分別取供試品溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液4 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，靜置10 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置10 min；加4%氫氧化鈉溶液5 mL，靜置10 min，加水定容至刻度，于510 nm波長處測定吸光度值。

2.2 提取影響因素單因素考察

乙醇體積分數：稱取夏枯草藥材20 g，共4份，分別加入300 mL體積分數分別為30%，50%，70%，90%的乙醇溶液，水浴加熱提取，提取2次，每次1.5 h，濾出殘渣，分別取濾液1 mL，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，得供試品溶液。依法測定總黃酮含量，由圖1 A可知，乙醇體積分數為50%時夏枯草中總黃酮提取量最大。

料液比：稱取夏枯草藥材20 g，共4份，按液料比為20∶1（V/m），30∶1（V/m），40∶1（V/m），50∶1（V/m）分別加入50%乙醇溶液，水浴加熱提取，提取1次，提取2 h，濾出殘渣，分別取1 mL，置10 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，得供試品溶液。依法測定總黃酮含量，由圖1 B可知，乙醇體積分數為50%，提取時間為2 h，液料比為40∶1（V/m）時，夏枯草中總黃酮提取量最高，繼續增大液料比，提取效果無明顯改善。

提取時間：稱取夏枯草藥材20 g，共5份，分別加入800 mL 50%乙醇溶液，水浴加熱提取，提取1次，分別提取2，3，4，5，6 h，濾出殘渣，取1 mL置10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容，得供試品溶液。依法測定總黃酮含量，由圖1 C可知，乙醇體積分數為50%，液料比為40∶1（V/m），提取時間為5 h時夏枯草總黃酮的提取量最高，繼續延長提取時間，提取效果不明顯。

單因素考察結果：確定了各影響因素的最佳水平，乙醇體積分數為50%，提取時間為5 h，液料比為40∶1（V/m），初步確定了夏枯草中總黃酮的提取工藝。

2.3 提取工藝（響應面法）

試驗設計：在單因素試驗結果的基礎上，根據Box－Behnken中心組合試驗設計原理，選取乙醇體積分數（因素A）、液料比（因素B）和提取時間（因素C）3個因素，采用三因素三水平的響應面分析方法，因素水平見表1。以液料比、乙醇體積分數和提取時間為自變量，總黃酮提取量為響應值，在提取1次的條件下，共安排17個試驗，其中12個為析因試驗，5個為中心試驗，用以估計誤差。試驗方案及結果見表2。

表1 試驗設計因素水平Tab.1 Factors and levels of single－factor test

表2 試驗設計方案與結果Tab.2 Scheme and results of test design

A.乙醇體積分數 B.液料比 C.提取時間圖1 夏枯草中總黃酮提取影響因素單因素考察A.Volume fraction of ethanol B.Liquid－solid ratio C.Extraction timeFig.1 Single－factor test of the factors affecting the extraction of total flavonoids from Prunellae Spica

模型擬合與方差分析：采用Design Expert軟件中的Box－Behnken試驗對響應值（總黃酮提取量）進行二次回 歸 分 析，結 果R＝－7.470＋0.473A＋0.155B＋2.462C＋0.000 500AB＋0.006 43AC－0.001 77BC－0.005 71A2－0.001 97B2－0.257C2（R2＝0.998 4）。由表3可知，模型項的Pr＞F值小于0.000 1，表明該二次方程回歸極顯著，且失擬項Pr＞F值為0.072 9，不顯著，說明該方程對試驗擬合較好，可較好地描述各因素與響應值間的真實關系。一次項A，B，C，二次項A2，B2，C2對響應值的影響顯著（P＜0.01），交互項對響應值的影響均不顯著（P＞0.05）。因此，各因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。根據回歸方程系數的估計值可知，各因素對夏枯草中總黃酮提取量的影響大小為乙醇體積分數＞提取時間＞液料比。在α＝0.05顯著水平下剔除不顯著項后，可得優化后的回歸方程R＝－7.470＋0.473A＋0.155B＋2.462C－0.005 71A2－0.001 97B2－0.257C2。

表3 模型擬合方差分析結果Tab.3 Results of ANOVA for model fitting

響應面分析：不同因素交互作用的響應面見圖2。由圖2 A可知，當提取時間為5 h時，總黃酮提取量隨乙醇體積分數的升高先升后降，提示料液比對提取量的影響較小。由圖2 B可知，當液料比為40∶1時，總黃酮提取量隨乙醇體積分數的升高先升后降，提示提取時間對其影響較小。由圖2 C可知，總黃酮提取量隨液料比和提取時間的變化影響不大。

A.乙醇體積分數－提取時間 B.乙醇體積分數－液料比 C.液料比－提取時間圖2 各因素交互作用影響總提取量的響應面和等高線圖A.Volume fraction of ethanol－extraction time B.Volume fraction of ethanol－liquid－solid ratio C.Liquid－solid ratio－extraction timeFig.2 Response surface and contour map of the interaction of various factors on the total extraction amount of total flavonoids from Prunellae Spica

2.4 提取條件優化及驗證

根據回歸模型可預測理論，響應值最大時的提取條件 為：A＝55.95，B＝44.34，C＝5.36，即 提 取 量 為181.307 mg，液料比44.34∶1（V/m），提取時間5.36 h。考慮到實際操作條件，擬定夏枯草總黃酮最佳提取條件為液料比44∶1（V/m），提取時間5 h，乙醇體積分數55%。以此提取條件檢驗響應面分析法建立回歸模型的正確性，測得總黃酮的提取量為173.341 mg，與理論預測值相比，差異不顯著。提示該回歸模型與實際情況擬合很好，響應面法可用于對夏枯草總黃酮提取條件進行回歸分析和參數優化。

2.5 抗氧化活性分析

DPPH自由基清除率測定：取總黃酮提取液和維生素C，分別配制質量濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL的供試品溶液和陽性對照溶液，分別取1.0 mL，加入1.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，混勻，室溫下充分反應30min，于517nm波長處測定吸光度，計算清除率。DPPH自由基清除率（%）＝（1－Ai/A0）×100%。式中，A0表示DPPH溶液的吸收值；Ai表示樣品與DPPH混合液的吸收值［10－11］。

ABTS＋·自由基清除率測定：取總黃酮提取液和維生素C，分別配制成質量濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL的供試品溶液和陽性對照溶液，分別取0.8 mL，精密量取稀釋后的ABTS＋·貯備液1.2 mL，混勻，靜置5 min，于734 nm波長處測定吸光度，按公式計算自由基清除率。

抗氧化活性分析：結果見圖3。總黃酮質量濃度在0.02～0.12 mg/mL范圍內，陽性對照溶液及夏枯草總黃酮提取物質量濃度隨著DDPH和ABTS＋·自由基清除率的增加而增加。在清除DPPH自由基試驗中，其半數清除質量濃度（IC50）和最大清除率分別為0.042 mg/mL和70%，維生素C分別為0.085 mg/mL和84%；在清除ABTS＋·自由基試驗中，其IC50和最大清除率分別為0.074 mg/mL和82%，維生素C分別為0.048 mg/mL和90%。結果顯示，夏枯草總黃酮提取物對DPPH和ABTS＋·自由基均有良好的清除效果，但不如維生素C。

A.DPPH自由基 B.ABTS＋·自由基圖3 夏枯草中總黃酮提取物對DPPH和ABTS＋·自由基的清除效果A.DPPH free radical B.ABTS＋·free radicalFig.3 Scavenging effect of total flavonoids from Prunellae Spica on DPPH and ABTS＋·free radicals

3 討論

3.1 統計方法選擇

現有文獻中關于夏枯草提取總黃酮的條件優化研究多采用的數理統計方法為正交設計法，其可同時考慮多種因素，并通過較少的試驗次數得到最佳因素水平組合，但不能在給定的連續區域內找到因素和響應值的對應關系（回歸方程）。但響應面分析法試驗次數少，周期短，求回歸方程精度高，可滿足其不足。

3.2 回歸方程

在單因素考察結果基礎上，以夏枯草總黃酮提取量為響應值，利用試驗設計軟件Design－Expert，采用Box－Behnken試驗原理建立了乙醇體積分數（%）、液料比和提取時間（h）與總黃酮提取量間的二次回歸模型，回歸模型擬合程度好，能真實反映各影響因素對響應值的影響。根據回歸系數顯著性檢驗結果，得到各因素對響應值影響的順序為乙醇體積分數＞提取時間＞液料比。

3.3 單因素考察和響應面考察優缺點

首先采用單因素考察法確定影響因素變量的大概最優范圍，作為響應面的零水平點，可減少響應面試驗所做的試驗數量，主要選取影響提取時間、液料比和乙醇體積分數影響較大的獨立因素進行優化。單因素考察僅單獨考察某個因素的影響，在實際試驗中要綜合考慮各因素間的干擾影響，故需要選擇較全面的響應面考察法，優選樣品提取的最佳工藝。

3.4 抗氧化活性

在篩選夏枯草中總黃酮最佳提取工藝的基礎上，對夏枯草中總黃酮抗氧化活性進行了初步研究，發現夏枯草中總黃酮對DPPH自由基和ABTS＋·自由基均有良好的清除作用，可為夏枯草的生物活性研究提供理論依據。